菌種的退化與復壯

1.菌種的退化現象 

隨著(zhù)菌種保藏時(shí)間的延長(cháng)或菌種的多次轉接傳代，菌種本身所具有的優(yōu)良的遺傳性狀可能得到延續，也可能發(fā)生變異。變異有正變（自發(fā)突變）和負變兩種，其中負變即菌株生產(chǎn)性狀的劣化或有些遺傳標記的丟失均稱(chēng)為菌種的退化。但是在生產(chǎn)實(shí)踐中，必須將由于培養條件的改變導致菌種形態(tài)和生理上的變異與菌種退化區別開(kāi)來(lái)。因為優(yōu)良菌株的生產(chǎn)性能是和發(fā)酵工藝條件緊密相關(guān)的。如果培養條件發(fā)生變化，如培養基中缺乏某些元素，會(huì )導致產(chǎn)孢子數量減少，也會(huì )引起孢子顏色的改變；溫度、pH值的變化也會(huì )使發(fā)酵產(chǎn)量發(fā)生波動(dòng)等。所有這些，只要條件恢復正常，菌種原有性能就能恢復正常，因此這些原因引起的菌種變化不能稱(chēng)為菌種退化。常見(jiàn)的菌種退化現象中，最易覺(jué)察到的是菌落形態(tài)、細胞形態(tài)和生理等多方面的改變，如菌落顏色的改變，畸形細胞的出現等；菌株生長(cháng)變得緩慢，產(chǎn)孢子越來(lái)越少直至產(chǎn)孢子能力喪失，例如放線(xiàn)菌、霉菌在斜面上多次傳代后產(chǎn)生“光禿”現象等，從而造成生產(chǎn)上用孢子接種的困難；還有菌種的代謝活動(dòng)，代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)能力或其對寄主的寄生能力明顯下降，例如黑曲霉糖化能力的下降，抗菌素發(fā)酵單位的減少，枯草桿菌產(chǎn)淀粉酶能力的衰退等。所有這些都對發(fā)酵生產(chǎn)均不利。因此，為了使菌種的優(yōu)良性狀持久延續下去，必須做好菌種的復壯工作。即在各菌種的優(yōu)良性狀沒(méi)有退化之前，定期進(jìn)行純種分離和性能測定。 

 

2. 菌種退化的原因 

菌種退化的主要原因是有關(guān)基因的負突變。當控制產(chǎn)量的基因發(fā)生負突變，就會(huì )引起產(chǎn)量下降；當控制孢子生成的基因發(fā)生負突變，則使菌種產(chǎn)孢子性能下降。一般而言，菌種的退化是一個(gè)從量變到質(zhì)變的逐步演變過(guò)程。開(kāi)始時(shí)，在群體中只有個(gè)別細胞發(fā)生負突變，這時(shí)如不及時(shí)發(fā)現并采用有效措施而一味移種傳代，就會(huì )造成群體中負突變個(gè)體的比例逐漸增高，最后占優(yōu)勢，從而使整個(gè)群體表現出嚴重的退化現象。因此，突變在數量上的表現依賴(lài)于傳代，即菌株處于一定條件下，群體多次繁殖，可使退化細胞在數量上逐漸占優(yōu)勢，于是退化性狀的表現就更加明顯，逐漸成為一株退化了的菌體。同時(shí)，對某一菌株的特定基因來(lái)講，突變頻率比較低，因此群體中個(gè)體發(fā)生生產(chǎn)性能的突變不是很容易的，但就一個(gè)經(jīng)常處于旺盛生長(cháng)狀態(tài)的細胞而言，發(fā)生突變的機率比處于休眠狀態(tài)的細胞大得多，因此，細胞的代謝水平與基因突變關(guān)系密切，應設法控制細胞保藏的環(huán)境，使細胞處于休眠狀態(tài)，從而減少菌種的退化。 

 

3. 防止退化的措施 

合理的育種 選育菌種時(shí)所處理的細胞應使用單核的，避免使用多核細胞； 

合理選擇誘變劑的種類(lèi)和劑量或增加突變位點(diǎn)，以減少分離回復；在誘變處理后進(jìn)行充分的后培養及分離純化，以保證保藏菌種純碎。這些可有效的防止菌種的退化。 

選用合適的培養基 有人發(fā)現用老苜蓿根汁培養基培養“5406”抗生菌—細黃鏈霉菌可以防止它的退化。在赤霉菌產(chǎn)生菌—藤倉赤霉的培養基中，加入糖蜜、天門(mén)冬素、谷氨酰胺、5-核苷酸或甘露醇等物質(zhì)時(shí)，也有防止菌種退化的效果。也有選取營(yíng)養相對貧乏的培養基做菌種保藏培養基，如培養基中適當限制容易利用的糖源葡萄糖等的添加，因為變異多半是通過(guò)菌株的生長(cháng)繁殖而產(chǎn)生的，當培養基營(yíng)養豐富時(shí)，菌株會(huì )處于旺盛的生長(cháng)狀態(tài)，代謝水平較高，為變異提供了良好的條件，大大提高了菌株的退化幾率。 

創(chuàng )造良好的培養條件 在生產(chǎn)實(shí)踐中，創(chuàng )造和發(fā)現一個(gè)適合原種生長(cháng)的條件可以防止菌種退化，如低溫、干燥、缺氧等。在棲土曲霉3．942 的培養中，有人曾用改變培養溫度的措施(從20-30℃提高到33-34℃)來(lái)防止它產(chǎn)孢子能力的退化。 

控制傳代次數 由于微生物存在著(zhù)自發(fā)突變，而突變都是在繁殖過(guò)程中發(fā)生而表現出來(lái)的。所以應盡量避免不必要的移種和傳代，把必要的傳代降低到最低水平，以降低自發(fā)突發(fā)的機率。菌種傳代次數越多，產(chǎn)生突變的幾率就越高，因而菌種發(fā)生退化的機會(huì )就越多。這要求不論在實(shí)驗室還是在生產(chǎn)實(shí)踐上，必須嚴格控制菌種的移種傳代次數，并根據菌種保藏方法的不同，確立恰當的移種傳代的時(shí)間間隔。如同時(shí)采用斜面保藏和其它的保藏方式（真空凍干保藏、砂土管、液氮保藏等），以延長(cháng)菌種保藏時(shí)間。 

利用不同類(lèi)型的細胞進(jìn)行移種傳代 在有些微生物中，如放線(xiàn)菌和霉菌，由于其菌的細胞常含有幾個(gè)核或甚至是異核體，因此用菌絲接種就會(huì )出現不純和衰退，而孢子一般是單核的，用它接種時(shí)，就沒(méi)有這種現象發(fā)生。有人在實(shí)踐中發(fā)現構巢曲霉如用分生孢子傳代就容易退化，而改用子囊孢子移種傳代則不易退化；還有人采用滅過(guò)菌的棉團輕巧地沾取“5406”孢子進(jìn)行斜面移種，由于避免了菌絲的接入，因而達到了防止退化的效果。 

采用有效的菌種保藏方法 用于工業(yè)生產(chǎn)的一些微生物菌種，其主要性狀都屬于數量性狀，而這類(lèi)性狀恰是最容易退化的。因此，有必要研究和制定出更有效的菌種保藏方法以防止菌種退化。 

 

4. 退化菌種的復壯 

退化菌種的復壯可通過(guò)純種分離和性能測定等方法來(lái)實(shí)現，其中一種是從退化菌種的群體中找出少數尚未退化的個(gè)體，以達到恢復菌種的原有典型性狀。另一種是在菌種的生產(chǎn)性能尚未退化前就經(jīng)常而有意識地進(jìn)行純種分離和生產(chǎn)性能的測定工作，以達到菌種的生產(chǎn)性能逐步有所提高。所以這實(shí)際上是一種利用自發(fā)突變不斷從生產(chǎn)中進(jìn)行選種的工作。具體的菌種的復壯措施如下： 

純種分離 采用平板劃線(xiàn)分離法、稀釋平板法或涂布法均可。把仍保持原有典型優(yōu)良性狀的單細胞分離出來(lái)，經(jīng)擴大培養恢復原菌株的典型優(yōu)良性狀，若能進(jìn)行性能測定則更好。還可用顯微鏡操縱器將生長(cháng)良好的單細胞或單孢子分離出來(lái)，經(jīng)培養恢復原菌株性狀。 

 

通過(guò)寄主進(jìn)行復壯 寄生型微生物的退化菌株可接種到相應寄主體內以提高菌株的活力。 

聯(lián)合復壯 對退化菌株還可用高劑量的紫外線(xiàn)輻射和低劑量的DTG聯(lián)合處理進(jìn)行復壯。