λ噬菌體DNA提取

λ噬菌體是最早使用的克隆載體，λ噬菌體的基因組是一長(cháng)度約為50kb的雙鏈DNA分子，它在宿主細胞有兩種生活途徑：其一是裂解生長(cháng)，環(huán)狀DNA 分子在細胞內多次復制，合成大量噬菌體基因產(chǎn)物，裝配成噬菌體顆粒，裂解宿主菌再進(jìn)行下一次感染；其二是溶源性生長(cháng)，即感染細胞內λ噬菌體DNA整合到宿主菌染色體DNA中與之一起復制，并遺傳給子代細胞，宿主細胞不裂解。平板培養時(shí)，裂解生長(cháng)形成噬斑。液體培養時(shí)，裂解生長(cháng)使菌液中宿主菌最后全部被裂解而釋放出大量的噬菌體顆粒。

經(jīng)過(guò)改造的λ噬菌體克隆位點(diǎn)可插入幾到幾十kb的外源DNA。許多cDNA和基因組文庫是以λ噬菌體作為克隆載體構建的。因此，在經(jīng)文庫篩選得到目的克隆后，我們常常需要利用λ噬菌體裂解生長(cháng)的特點(diǎn)，培養獲得大量的噬菌體顆粒，并提取λ噬菌體DNA來(lái)開(kāi)展進(jìn)一步的工作。

一、試劑準備

1.LB液體培養基：胰化蛋白胨（細菌培養用）10g，酵母提取物（細菌培養用）5g，NaCl 10g，加ddH2O至1000ml，完全溶解，分裝小瓶，15lbf/in2高壓滅菌20min。

2.1.5%瓊脂LB固體培養基: 稱(chēng)取1.5g瓊脂粉放入300ml錐形瓶,加100mlLB，15 lbf/in2 高壓滅菌20min，稍冷卻，制備平皿。

3.20% 麥芽糖：麥芽糖20g，加ddH2O 至100ml，0.22μm濾膜過(guò)濾。

4.SM液：NaCl 5.8g，MgSO4·7H2O 2g，1M Tris·CL（PH7.5）50ml，2%明膠 5ml，加ddH2O 至1000ml。15lbf/in2高壓滅菌20min。

5.RNase A 10mg/ml，TE配制，沸水浴15min，分裝后貯存于-20℃。

6.DNase I 10mg/ml，TE配制，分裝后貯存于-20℃。

7.PEG 80008，10%SDS9，EDTA: 0.5M pH8.03，苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），異丙醇，無(wú)水乙醇，70%乙醇

 

二、操作步驟

1.λ噬菌體平板培養

(1)用SM液10倍梯度稀釋λ噬菌體原種。

(2)取0.1ml各梯度稀釋離心到一消毒微量離心管中，加0.2ml新鮮培養的宿主菌，加麥芽糖(0.2%)，MgSO4(10mM)，37℃溫育20min，使噬菌體顆粒吸附于細菌。

(3)取熔化（47℃）0.7%瓊脂LB固體培養基3ml與上述管混勻，立即倒入預備（2-4天）的含凝固1.5%瓊脂LB固體培養基的平板內，輕輕晃動(dòng)平板使均勻分布。

(4)37℃培養6-8hr后，觀(guān)察噬斑形成。

(5)用剪去部分頭部的吸頭挖取單個(gè)噬斑到0.5ml的SM液中，加0.05ml氯仿，震蕩。37℃溫育10min。

(6)重復⑴-⑷，獲得單個(gè)噬斑滴度。

2. λ噬菌體液體培養

(1)取2ml新鮮培養的宿主菌，離心，0.4ml LB培養基重懸，加λ噬菌體0.1ml（新鮮獲得的單個(gè)噬斑，依滴度使之與宿主菌比約1/500-1000）。

(2)加麥芽糖（0.2%），MgSO4（10mM），37℃溫育20min，使噬菌體顆粒吸附于細菌。

(3)加到100mlLB液體培養基中，加麥芽糖（0.2%），MgSO4（10mM），37℃搖震培養9-12hr后可見(jiàn)裂解發(fā)生。

(4)加0.1ml氯仿，37℃繼續搖震培養10-20min。

3. λ噬菌體DNA提取

(1)將上述裂解液轉移至離心管，離心8000g×10min，去細菌碎片，取上清液。

(2)加RNase A、DNaseI 至1μg/ml， 37℃溫育30min。

(3)加9.3g PEG 8000，5.8g NaCl，搖勻至溶解，冰浴1hr或4℃過(guò)夜。

(4)4℃離心10000g×20min，去上清液。

(5)加2ml SM液，充分洗溶管壁及沉淀，移到新微量離心管，加20μl 10%SDS，20μl 0.5M EDTA，68℃15min。

(6)加等體積苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），混勻，離心12000g×5min，取上層液到一新微量離心管，加等體積氯仿/異戊醇（24：1），混勻，離心12000g×5min。

(7)取上層液到一新微量離心管，加等體積異丙醇，混勻，-20℃1hr，4℃離心12000g×10min，去上清液。

(8)1ml預冷的70%乙醇洗滌沉淀1-2次，4℃離心8000g×7min，棄上清，將沉淀室溫下晾干。

(9)沉淀溶于20μl TE，-20℃保存備用。

 

三、注意事項

1.用于裂解的噬菌體、宿主菌為新鮮培養獲得時(shí)，裂解好、裂解噬菌體收獲量大。

2.液體培養裂解時(shí)，如到培養時(shí)間時(shí)裂解尚未發(fā)生，可適當提高培養溫度或加大搖震速度。

3.RNase A 、DnaseI消化不全，DNA、RNA可粘走部分噬菌體。

4.苯酚/氯仿抽提時(shí)，注意PEG、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)污染，它們會(huì )影響限制性?xún)惹忻盖懈睢?/DIV>

 

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