噬菌體的分離和鑒定

 

部分菌株對應的噬菌體分離過(guò)程步驟：

 

(1) 以新鮮鴿糞4g 加入100ml 普通液體培養基內，放入37 ℃溫箱培養24h。

(2) 次日從中取出10ml70 ℃加熱30min ,離心2000r/ 10min ,上清液用濾器過(guò)濾后保存于4 ℃冰箱備用。

(3) 在普通瓊脂平板底面分別注明1、2、3 號。

(4)在1 號平板接種事先培養好的6h 幼齡菌乙型副傷寒桿菌一接種環(huán)；2 號平板接種幼齡菌福氏痢疾桿菌一接種環(huán);3 號平板接種幼齡菌大腸桿菌一接種環(huán),各平板的細菌密集涂布于瓊脂平板表面。

(5) 再用無(wú)菌接種環(huán)取鴿糞培養濾液一接種環(huán),分別滴加于3 個(gè)已接種細菌的平板中央,放入37 ℃溫箱孵育24h。

 

先后從農貿市場(chǎng)采集各類(lèi)海產(chǎn)品158 份, 分別用15 株假單胞菌作指示菌, 共分離到27 株噬菌體, 分離率為17.11%。檢出的噬菌體經(jīng)實(shí)驗室反復增殖、裂解等鑒定試驗, 從中精選出9 株裂解力較強, 生物學(xué)性狀較典型的噬菌體, 分別用雙層瓊脂法作單斑純化培養。這9 株噬菌體的噬菌斑圓形透明, 邊緣有的整齊有的稍不整齊, 直徑均在110～210 mm; 在電鏡下的形態(tài)可見(jiàn)有頭部和尾部, 均呈蝌蚪狀; 增殖液的效價(jià)均可達10829pfu/m l。

 

在有指示菌的雙層瓊脂平板上逐格滴加備用的待檢噬菌體液,進(jìn)行交叉裂解試驗,即每一株菌均被所有待檢噬菌體液逐一滴加。待平皿干后,置37 ℃培養過(guò)夜。若有相應的噬菌體存在,即可在平皿上出現裂解噬斑(即為陽(yáng)性) ,不裂解者為陰性。對分離到的每一噬菌體均經(jīng)單噬斑分離純化3 次以上,增殖后置4 ℃冰箱保存。

 

4.1 　材料與方法

4.2 　菌株

噬菌體分離所用的指示菌為河流弧菌29301 , 用于宿主范圍測定的菌株共8 株: 河流弧菌Ⅱ9302 , 9401 , 9402 , 9403 , 9404 , 9501 , 9502 及9503 均為本實(shí)驗室保存。

4.3 　培養基

培養河流弧菌及噬菌體分離所用的培養基為海水胰蛋白胨培養基。其中: 胰蛋白胨10g , 酵母膏5g , 陳海水1000mL , pH712～715 。制作底層培養基時(shí), 加瓊脂15g ; 制作上層培養基時(shí), 加瓊脂7g。

4.4 　樣品的采集和噬菌體的分離

 

1996、1997 年兩個(gè)夏季, 從大連市水產(chǎn)養殖公司所屬皺紋盤(pán)鮑養殖區的不同地點(diǎn)采集海水和海底淤積物, 每次采集10 個(gè)樣品, 每個(gè)樣品為同一地點(diǎn)采集的3 份不同水樣或海底淤積物混合而成。為了分離噬菌體, 取海底淤積物100g , 加入等量海水, 充分振蕩30min , 靜置, 過(guò)濾, 取上清液100mL 加入50mL 3 倍濃縮的海水胰蛋白胨及2mL 濃度為1012個(gè)/ mL 的河流弧菌2 菌懸液, 30 ℃培養過(guò)夜, 以促進(jìn)噬菌體的增殖。海水樣品過(guò)濾后按上述方法直接富集。經(jīng)富集后的培養液加入1/ 10 的氯仿, 30 ℃靜止1h , 于4000r/ min 離心20min , 取上清液用于雙層瓊脂法分離噬菌體。為了純化噬菌體, 挑取單斑連續傳代, 重復進(jìn)行5 次以上, 選擇平板上所有噬菌斑形態(tài)和大小基本一致的材料,進(jìn)行下一步研究。