碘化物緩沖液： 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA, 4 M NaCl。室溫避光貯存。用的是NEB手冊上寫(xiě)的方法。
1. 按上述方法進(jìn)行噬菌斑擴增，在第一步離心后，將500 µl含噬菌體上清轉入一新鮮離心管。
2. 加200 µl PEG/NaCl，顛倒混勻，室溫放置10 min。
3. 離心10 min，棄上清液。
4. 短暫離心，小心吸去殘余上清。
5. 沉淀物徹底重懸于100 µl碘化物緩沖液中，加入250 µl乙醇。室溫溫育10 min。短時(shí)間的室溫溫育使單鏈噬菌體DNA沉淀而大多數噬菌體蛋白保持在溶液中。
6. 離心10 min，棄上清。用70%的乙醇洗沉淀，短暫真空干燥。
7. 沉淀重懸于30 µl TE [10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA]中。
8. 5 µl的上述模板溶液足夠進(jìn)行35S或33P標記的手工雙脫氧測序, 或染料標記的自動(dòng)循環(huán)雙脫氧測序。根據測序方法的不同, 適當增減模板用量。
在用碘化物溶液提取噬菌體單鏈DNA過(guò)程中需要注意以下事項：
1.噬菌體上清是經(jīng)過(guò)兩次離心，并吸取上層80%液體得到，去除菌體。
2.操作過(guò)程在室溫進(jìn)行
3.沉淀要用NaI溶液徹底吹打
4.與碘化物溫育時(shí)間不能超過(guò)10分鐘
5.離心時(shí)間準確，不能太長(cháng)
大量白色沉淀就是蛋白，主要是操作過(guò)程中不正確導致的噬菌體蛋白沉淀。
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