細菌的局限性轉導實(shí)驗原理、材料和實(shí)驗步驟

 

 

轉導是由噬菌體為媒介將一個(gè)細胞的遺傳物質(zhì)轉移給另一個(gè)細胞的過(guò)程。隨著(zhù)分子遺傳學(xué)的發(fā)展，轉導已成為基因精細結構分析的常用方法。轉導可分為局限性轉導和普遍性轉導二大類(lèi)。

本實(shí)驗試圖用局限性轉導為例，用噬菌體（λ）專(zhuān)一性轉導半乳糖發(fā)酵基因的現象來(lái)說(shuō)明轉導的基本原理。并初步掌握轉導實(shí)驗的基本方法。

用E Coli k₁₂ (λ) gal 作為供體菌，此菌帶有原噬菌體（λ）�？刂瓢肴樘前l(fā)酵的基因在細菌染色體上和（λ）緊密連鎖。當此菌體受紫外光誘導后，原噬菌體被釋放出來(lái)，其中有一定比例的噬菌體帶有鄰近的半乳糖發(fā)酵基因。這種噬菌體稱(chēng)λdg，這種噬菌體在感染另一不能發(fā)酵半乳糖的菌體時(shí)（即受菌體）就有可能使其轉變成為能發(fā)酵半乳糖的菌體。整個(gè)過(guò)程可以下圖表示：

                K₁₂（λ）gal⁺（供體菌）

                         ↓UV

                       λgal⁺

                         ↓

K₁₂ S gal^-（受體菌）→ K₁₂ S gal^-/ (λ) gal⁺（轉導子）

上述轉導方式產(chǎn)生轉導子的頻率是很低的，稱(chēng)低頻轉導。我們選用K₁₂（λ/λgal）雙重溶源菌作供體菌，它經(jīng)U、V誘導裂解后，可含有大量的帶gal⁺基因的轉導顆粒，故轉導頻率很高，稱(chēng)高頻轉導。

 

大腸桿菌（E Coli）K₁₂（λ）gal⁺，帶有原噬菌體（λ）和缺陷噬菌體（λdg）能發(fā)酵半乳糖，作為供體菌。

K₁₂ S gal^-，不帶噬菌體，不能發(fā)酵半乳糖，對噬菌體（λ）敏感。作為受體菌及測定噬菌體（λ）效價(jià)的指示菌。

 

1.用具：6cm培養皿                1套

       9cm培養皿                6套

        1.5ml離心管              5支

        離心管                    2支

 

2.培養基

（1）       LB液體培養基

（2）       加倍肉湯培養液2ml成分同LB培養液，濃度加倍。

（3）       半乳糖EMB培養基：伊紅（Y）0.4克、美蘭0.06克、半乳糖10克、蛋白胨10克、K₂HPO₄ 2克、蒸餾水、1000ml、pH 7.0-7.2

（4）       磷酸緩沖液：5ml(用1×A)

KH₂PO₄      1.5g          

K₂HPO₄      9g                                 

 蒸餾水     1000ml   pH7.0

 

3.藥品：氯仿0.2ml

 

1.噬菌體的誘導和裂解液的制備

第一天：傍晚，從供體菌斜面挑取一環(huán)接種于5ml的LB培養液中，37℃培養過(guò)夜。

第二天：吸取1ml接種于裝有5ml LB培養液的離心管中，續培養3小時(shí)。（另吸取0.1ml，涂一皿，作供體菌對照）

供體菌培養物經(jīng)3000轉/分離心10分鐘棄去上清液，加4ml磷酸緩沖液制備成菌懸液。

吸取2ml到直徑6cm的培養皿中，經(jīng)紫外線(xiàn)處理（15瓦。燈距40厘米），打開(kāi)培養皿蓋子照射20秒鐘后加入加倍濃度的肉湯2ml，在37℃避光培養2-3小時(shí)。

用1ml移液槍把上述培養物轉入5ml的離心管中。再加0.2ml氯仿（4-5滴）。劇烈振蕩半分鐘，靜止5分鐘，以4000轉/分離心15分鐘。小心把上清液用無(wú)菌滴管轉稱(chēng)到另一試管，此即噬菌體（λ）的裂解液。

2.受體菌的制備。

第一天：傍晚，從受體菌斜面挑取一環(huán)接種于5ml LB培養液中，37℃培養過(guò)夜。

第二天：吸取1ml接種于裝有5ml LB培養液的離心管中，繼續培養3小時(shí)。

3.轉導實(shí)驗（點(diǎn)滴法）：

取倒好的EMB培養基平板2只，在皿底用標記筆按下圖中的樣子畫(huà)好取一滿(mǎn)環(huán)受體菌，涂出一條菌帶，共涂?jì)蓷l。37℃培養1.5小時(shí)，取出平板，在兩個(gè)圓圈和四個(gè)方格處，各加一環(huán)噬菌體裂解液，培養2天，觀(guān)察結果。

4.轉導頻率的測定：

取受體菌0.5ml于離心管中，在37℃預熱數分鐘后，加0.5ml噬菌體裂解液，搖勻，置37℃水浴中保溫15分鐘后，稀釋到10^-3，取10^-1、10^-2和10^-3的稀釋液0.1ml在預先倒好的EMB平板上涂布，同時(shí)，取受體菌0.1ml涂一皿，作為對照，37℃培養48小時(shí)，統計轉導子數目算出轉導頻率。

 

1.點(diǎn)滴法結果

 

2.轉導頻率測定