結核桿菌（Mycobacterium tuberculosis）的特性和檢測方法

 

結核桿菌與麻風(fēng)桿菌是分枝桿菌屬中的主要病原菌。結核桿菌菌體細長(cháng)略帶彎曲，有分枝生長(cháng)趨勢。菌體含脂量高，與其抗酸特性、抵抗力特性、致病性與免疫性等都有密切關(guān)系。該菌營(yíng)養要求高，生長(cháng)緩慢，形成“菜花狀”菌落。

 

結核病人病灶中查到結核桿菌，是病原學(xué)診斷的重要依據，根據感染部位不同，可采集病人的痰、尿、糞便、腦脊液、胸腹水、胃液等，按以下程序進(jìn)行檢驗。

 

1.  液體培養基（蘇通氏培養基、小川培養基、血清酸性培養基等）結核桿菌生長(cháng)表現：標本材料經(jīng)前處理（即酸堿處理，可液化標本，也可殺死雜菌，還可濃縮集菌）后接種液體培養基，35℃培養1-2周，由于表面生物，可在培養基表面表成污灰、干燥、有皺褶的菌膜。 2.  固體培養基（改良羅氏培養基、丙酮酸鈉培養基等）結核桿菌生長(cháng)表現：標本材料經(jīng)前處理后，接種固體培養基，37℃培養2-4周，在培養基表面可形成乳白或米黃色、不透明、粗糙顆粒狀或節狀堆聚的菌落，呈現“菜花狀”。 

3.  結核桿菌快速培養檢測方法：無(wú)菌手續將前處理后的材料涂片，置液體培養基中，35℃恒溫箱CO2培養箱內培養，3-5日后，每隔日取出一玻片，染色鏡檢，可快速獲得結果。

 

三、齊~尼（Ziehl-Neelsen）抗酸染色法（操作） 

【原理】

結核桿菌對苯胺染料不易著(zhù)色，若加溫或延長(cháng)染色時(shí)間使其著(zhù)色后，再用3%鹽酸酒精處理也不易脫色，再經(jīng)美蘭復染，結核桿菌及其他分枝桿菌仍呈紅色，而非抗酸菌和細胞雜質(zhì)等呈藍色。

 

【材料】

1.   結核病人痰液：采取清晨第一口粘痰，或濃縮集落菌法處理過(guò)的痰標本。 

2.  抗酸染色液 

3.   載物玻片、玻片夾、酒精燈、臘筆等。

 

【方法】

      1.  無(wú)菌手續采取痰液涂片，自然干燥，火焰固定。 

　　2.  用臘筆將涂面局部隔開(kāi)，滴加石炭酸復紅染液，酒精燈上加熱至出現蒸氣。切勿沸騰，亦不可使染液干涸。如有干涸的趨勢，應及時(shí)補加染液。持續染色5-8分鐘，待冷后流水漂去多余的染液。 

　　3.  用3%鹽酸酒精清脫色，脫至涂面無(wú)色為止，約1-3分鐘，自來(lái)水沖洗。 

　　4.  滴加呂氏美蘭染液復雜30秒~1分鐘，水洗。自然干燥或吸干后油鏡檢查。

 

【結果】

      1.   結核桿菌呈現細長(cháng)，略有彎曲的紅色菌體，有的可表現出分枝特征，有的菌體表現有多數濃染顆粒。結核桿菌大多分散排列，亦可以見(jiàn)到有縱行條索狀排列。 

　　2.  涂片染色能查到結核桿菌者，一般需要每毫升痰液內含菌量至少應有500個(gè)以上，甚至需達到5萬(wàn)以上。故材料多進(jìn)行濃縮集菌處理，以提高檢出陽(yáng)性率，也造成在染色標本片觀(guān)察中，不一定每個(gè)視野都能看到結核桿菌。 

　　3.  結核桿菌易發(fā)生變異，在陳舊培養基或臨床治療后標本材料中，結核桿菌往往菌體斷裂，或形成非抗酸性革蘭氏陽(yáng)性的短桿狀、球狀顆粒，亦稱(chēng)Much顆粒。 

　　4.  標本已經(jīng)高壓滅菌處理，不影響染色結果，也保證操作者的安全。

 

此系用金胺熒光素染擴酸性細菌的方法，簡(jiǎn)便易行，但不具特異性。金胺染色法有多種、現列于后表，可選擇使用，應用熒光顯微鏡檢查結果。

 

【材料】

      1.   動(dòng)物：體重200~250克豚鼠2只

　　2.   結核桿菌培養物或結核病人檢驗材料（痰、尿、糞、腹水等材料經(jīng)濃縮集菌）

　　3.   注射器及消毒用材料等。

 

【方法】

      1.   選取結核菌素試驗為陰性的豚鼠兩只。

　　2.   吸取結核桿菌懸液或病人檢材，注入豚鼠腹股溝皮下0.1ml

　　3.   注射后每周定期檢查一次，觀(guān)察豚鼠腹股溝淋巴結是否腫大，局部變硬，化膿及體重減輕、體溫升高等癥狀。

　　4.   給豚鼠作結核菌素試驗，是否出現陽(yáng)性結果。

　　5.   6周后，將豚鼠進(jìn)行解剖，觀(guān)察淋巴結是否腫大，有無(wú)干酪性病變，肝、脾、肺等是否腫大，表面有無(wú)灰白色結節病灶，取可疑病灶進(jìn)行涂片染色鏡檢和分離培養。若為陽(yáng)性結果，可報告“動(dòng)物接種后××天查到有結核菌感染”。如無(wú)癥狀及病變者，可報告為陰性。

 

【材料】

結核病人24小時(shí)痰液，細口瓶，0.02%酚紅液、汽油，NaOH，無(wú)菌生理鹽水等。

 

【方法】

(一)漂浮法：

      1.   取24小時(shí)痰液15毫升，裝入細口瓶?jì)�，加�?倍量0.5%NaOH搖勻，高壓滅菌或煮沸20—30分鐘殺菌。

　　2.   待冷后加入汽油2毫升（二甲苯也可以），用力振蕩20—30分鐘，用生理鹽水加至液面與瓶口齊，靜置半小時(shí)。

　　3.   取瓶口表面油狀物涂于載物玻片上，微微加熱，干后再加，如此重復5—6次，至厚度適宜，烘干待冷，抗酸染色，油鏡頭檢查。

 

(二)沉淀法：

      1.   取痰液1份或2倍量4%NaOH，高壓無(wú)菌或煮沸20—30分鐘后，加入0.02%酚紅指示劑0.1毫升，劇烈振蕩混勻，亦可置37℃水浴消化30分鐘。

　　2.   矯正PH為7.0，3000轉/分離心30分鐘，棄去上清液。

　　3.   取沉淀物涂片染色鏡檢。若進(jìn)行分離培養和動(dòng)物接種，可免去高壓滅菌或煮沸的程序。

 

附錄：抗酸染液的配制

      1.   石炭酸復紅液：稱(chēng)取鹼性復紅4克，溶于95%酒精100毫升中成飽和液。再取飽和液10毫升與5%石炭酸溶液90毫升混勻即成。

　　2.   3%鹽酸酒精：取濃鹽酸3毫升，95%酒 97毫升混合。

　　3.   呂弗勒氏鹼性美蘭液：稱(chēng)取美蘭2克，溶于95%酒精100毫升中，配成飽和液，取飽和液30毫升，再加入蒸餾水100毫升及10%氫氧化鉀水溶液0.1毫升即成。