細菌的人工培養方法

 

了解常用的液體、固體和半固體培養基的成分、制備方法和用途。初步掌握各種培養基接種技術(shù)；觀(guān)察細菌在培養基中的生長(cháng)現象；認識菌落、菌苔。

 

培養基是用人工方法將微生物生長(cháng)繁殖所需的多種營(yíng)養物質(zhì)調配在一起，形成的一種營(yíng)養物質(zhì)的混合物，用以分離、傳代和培養細菌。按培養基的用途分為基礎（普通）培養基、營(yíng)養培養基、鑒別培養基，選擇培養基、厭氧培養基等。按培養基的物理形狀又分為液體、固體和半固體三種。

 

三角燒瓶、天平、試管、平皿、高壓消毒滅菌器。

 

培養基是人工配制的適合微生物生長(cháng)繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營(yíng)養基質(zhì)，用以培養、分離、鑒定、保存各種微生物或積累代謝產(chǎn)物。在自然界，微生物種類(lèi)繁多，營(yíng)養類(lèi)型多樣，加之實(shí)驗和研究目的不同，所以培養基的種類(lèi)很多。但是，不同種類(lèi)的培養基中，一般應含有水分、碳源、氮源、無(wú)機鹽、生長(cháng)因子等。

 

不同的微生物在固體、半固體和液體培養基中能表現出各自特有的培養特征，這些特征可以作為不同種類(lèi)微生物的鑒別特征之一。了解它們的培養特征、掌握其生長(cháng)規律對識別、控制和利用微生物具有重要價(jià)值。

 

（一）常用培養基的制備

1、普通液體培養基

(1)將新鮮的精牛肉除去脂肪和筋膜制成肉餡，取500克牛肉餡加l000ml蒸餾水，置4℃冰箱浸泡過(guò)夜，使牛肉中的水溶性營(yíng)養物質(zhì)充分浸出。

(2)次日將浸泡過(guò)夜的牛肉餡加熱煮沸30分鐘，放涼，使殘余的脂肪凝固，然后用紗布和濾紙過(guò)濾，最后將濾液補足為原量，此種液體為牛肉浸汁。

(3)取1 000ml牛肉浸汁加蛋白胨10克，氯化鈉5克加熱溶解，冷至50℃左右時(shí)用氫氧化鈉調整pH至7．6，再煮沸10分鐘(因牛肉浸汁中部分碳水化合物，經(jīng)加熱破壞產(chǎn)酸，影響pH；產(chǎn)生多磷酸鹽，培養基不澄清)待冷卻后，再調整pH至7．6，然后以濾紙過(guò)濾，濾液必須澄清，此種液體稱(chēng)為肉湯培養基。

(4)將肉湯培養基分裝于試管或三角燒瓶中，塞好試管和瓶塞，包裝好后，用15磅(121℃)蒸氣15～30分鐘滅菌。待冷后，置4℃冰箱中保存備用。牛肉湯培養基主要用于純種細菌的培養和增菌，也是其它培養基的基礎。

 

2、普通瓊脂培養基

(1)取100ml牛肉湯加入2～3克瓊脂(根據瓊脂凝固程度決定)。

(2)加熱100℃溶化后，趁熱調整pH為7．4。

(3)分裝于試管或三角燒瓶中，塞好試管和瓶塞，包裝好后，用15磅滅菌15～30分鐘。

(4)待培養基冷至50℃左右無(wú)菌操作倒入無(wú)菌試管，趁熱將試管斜置，冷凝后即為瓊脂斜面培養基；將培養基倒入無(wú)菌平皿，平放，待凝固后即為普通瓊脂平板。置4℃冰箱中保存備用。瓊脂斜面培養基主要用于純種細菌的培養，瓊脂（瓊脂血）平板主要用于雜種細菌的分離和藥物敏感性試驗等。

 

3、半固體培養基

其制備方法基本上與普通瓊脂培養基相同，只將瓊脂的用量改為0．3％～0.5％即可。通常分裝于試管內占試管體積的1/3的量，高壓滅菌后直立，使其凝固成高層。半固體培養基可供檢查細菌動(dòng)力和保存菌種之用。

 

4、血液瓊脂培養基： 

(1)將制好的普通瓊脂培養基高壓滅菌后。

(2)待冷至56℃左右時(shí)，加入5％～10％脫纖維的無(wú)菌的綿羊的血液（也可用家兔血和人血），混勻(注意勿產(chǎn)生氣泡)，分別倒人滅菌試管或平皿中，即制成血瓊脂斜面或血液瓊脂平板。置4℃冰箱備用，血液瓊脂平板是咽拭子最常用的培養基。

 

5、蛋白胨水培養基：

取100ml蒸餾水，加入蛋白胨1克和氯化鈉0．5克，加熱溶解，待冷卻后，調整pH為7．6，分裝于試管或三角燒瓶中，15磅滅菌15～30分鐘，待冷，置4℃冰箱中保存。蛋白胨水培養基常用于制備單糖發(fā)酵管或用于檢查細菌的吲哚試驗等。

 

（二）細菌培養基的接種方法

1、分離培養法(平板劃線(xiàn)法)

 

（1）分區劃線(xiàn)：

①右手持接種環(huán)在酒精燈火焰上燒灼滅菌，待冷（稍待約5～10秒鐘），取細菌培養物（或病人材料）少許。

②左手持瓊脂平板底部拇指稍頂開(kāi)平皿蓋（接種環(huán)能進(jìn)入方便操作即可），并靠近酒精燈火焰(火焰周?chē)�直�?0cm左右范圍空氣中細菌含量少)附近操作，以免空氣中雜菌落入。右手握持沾菌的接種環(huán)在瓊脂平板邊緣上端來(lái)回劃線(xiàn)涂成菌膜，菌膜占總面積的1/10，劃線(xiàn)時(shí)接種環(huán)的面與平板面成45度角輕輕接觸，以手腕的力在平皿表面做輕輕的滑動(dòng)，劃線(xiàn)要求密集平行，充分利用平板表面。

③燒灼接種環(huán)，殺滅環(huán)上殘留的細菌，待接種環(huán)冷卻后將接種環(huán)通過(guò)菌膜處作連續劃線(xiàn)，以占平皿面積的1/5，為一區劃線(xiàn)。

④左手旋轉平皿90度左右，燒灼接種環(huán)，殺滅環(huán)上殘留的細菌，待接種環(huán)冷卻后，繼續用接種環(huán)通過(guò)一區2～3次連續劃線(xiàn)占平皿面積的另1/5，為第二區劃線(xiàn)。

⑤如此重復操作3～5次。

將培養皿放置37℃溫箱內，翻轉培養(即皿底在上，蓋在下)。經(jīng)37℃，24小時(shí)培養后取出，觀(guān)察瓊脂平板表面生長(cháng)的各種菌落，注意其大小、形狀、邊緣、表面、透明度、顏色等性狀。在血瓊脂平板上，尚可觀(guān)察菌落四周有無(wú)溶血現象。

 

(2)連續劃線(xiàn)法：

這種方法主要適應于熟練技術(shù)人員。以無(wú)菌操作取標本涂抹于平板邊緣的上端成菌膜，占平板面積的1/10，酒精燈火焰上燒灼接種環(huán)法滅菌，待冷卻后重復涂抹菌膜一部分，再向下連續劃線(xiàn)至平板底部，經(jīng)37℃培養18～24小時(shí)后觀(guān)察生長(cháng)情況。

 

2、斜面培養基接種方法

①左手的拇指、食指、中指、無(wú)名指分別持握菌種管與接種管，將兩管并列，略?xún)A斜斜面部均向上，右手分別轉動(dòng)兩管棉塞，以便接種時(shí)易于拔取。

②右手執持接種環(huán)(姿勢與握鉛筆相似)，接種環(huán)和環(huán)柄的金屬部分酒精燈燒灼滅菌。

③以右手手掌與小指、小指與無(wú)名指分別拔取并夾持兩管棉塞，將兩管管口迅速通過(guò)酒精燈火焰滅菌。

④將滅菌并已冷卻的接種環(huán)伸入菌種管中，從斜面上刮取菌苔少許，退出菌種管，再伸進(jìn)待接種的培養基管，自斜面底部輕輕向上劃一條直線(xiàn)，再次深入底部在瓊脂表面輕輕的蛇形劃線(xiàn)。沾菌的接種環(huán)，進(jìn)出試管時(shí)，均不應觸及試管內壁。

⑤接種完畢，接種環(huán)酒精等火焰滅菌，將兩管管口迅速通過(guò)酒精燈火焰2～3次滅菌，塞回棉塞，標記培養管。經(jīng)37℃孵育18～24小時(shí)后觀(guān)察生長(cháng)情況。

 

3、液體培養基接種法

①握持菌種管及待接種即肉湯管的方法同斜面培養基接種法。

②接種環(huán)滅菌冷卻后，伸入菌種管刮取少量菌苔退出菌種管，再伸人肉湯管，在接近液面的管壁上輕輕研磨，并蘸取少許肉湯調和，使菌混合于肉湯中。