細菌培養及CaCl2法制備感受態(tài)細胞

 

實(shí)驗目的： 

明確培養基的配制原理；通過(guò)對LB培養基的配制，掌握配制培養基的一般方法和步驟；掌握細菌的接種、培養的無(wú)菌操作方法和步驟。 

 

實(shí)驗原理： 

重組DNA分子（質(zhì)粒、噬菌體、粘性質(zhì)粒）必須導入宿主菌中，通過(guò)細菌培養來(lái)擴增所需的重組DNA。 

大腸桿菌與其它微生物一樣，都具有穩定遺傳性和變異性、遺傳性，保證微生物本身特征的相對穩定，即無(wú)性繁殖過(guò)程中能夠保持原有的性狀，為菌種保藏提供了有利因此。 

 

菌種保藏的原理是：通過(guò)低溫、干燥、隔絕空氣和斷絕營(yíng)養等手段，以達最大限度地降低菌種的代謝強度，抑制細菌的生長(cháng)和繁殖。由于菌種的代謝相對靜止，生命活動(dòng)將處休眠狀態(tài)，從而可以保藏較長(cháng)時(shí)間。要求保存的菌種在復蘇后除保持以前的生活與繁殖能力、不發(fā)生形態(tài)特征、生理狀態(tài)及遺傳性狀的改變外，還不允許污染任何雜菌。此外，在保存前應確保菌種的單純性，先分離單菌落后進(jìn)行鑒定，然后再繁殖保存。 

 

常用的長(cháng)期保存法有：液體石蠟法、硅膠保存法、加入甘油或二甲基亞砜（DMSD）等保護劑。目前比較常用的甘油低溫保存法(-70~-196)℃，由于在-70℃或液氮中凍存，細菌內的酶活性均己停止，即代謝處于完全停止狀態(tài)，故可以長(cháng)期保存。在0~-70℃溫度范圍內，水晶呈針狀，極易招致細菌的嚴重損傷。用電鏡觀(guān)察，可見(jiàn)細菌的核膜上有大量針尖樣小孔。因此，為了避免0~-70℃冰晶的形成和細菌膜兩側離子平衡的破壞，需要加保護劑。甘油可降低冰點(diǎn)，在緩慢的凍結條件下，能使細菌內水分在凍結前透出細菌外。貯存在-70℃以下低溫中能減少冰晶形成，甘油對細菌無(wú)毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細菌。甘油的使用濃度范圍為15%-50%，一般常用30%。在保存瓶中按1：1加入60%的甘油和菌液，混勻后貯存于-70℃或液氮中。復蘇后細菌仍能生長(cháng)，活力不受任何影響。 

 

培養基是人工地將多種物質(zhì)按各種微生物生長(cháng)的需要配制而成的一種混合營(yíng)養基質(zhì)，用以培養或分離各種微生物。因此，營(yíng)養基質(zhì)應當有微生物所能利用的營(yíng)養成分（包括碳源、氮源、能源、無(wú)機鹽、生長(cháng)因素）和水。按培養基的物理狀態(tài)分液體培養基和固體培養基。固體培養基是在液體培養基中加入凝固劑即為固體培養基。實(shí)驗用的凝固劑有瓊脂、明膠和硅膠，后者用于配制自養微生物的固體培養基。對其他多數微生物來(lái)講，以瓊脂最為合適，一般加入1.5~2.5%即可凝固成固體。此培養基可供分離、鑒定、活菌計數、菌種保藏等用。液體培養基是沒(méi)有加瓊脂，配好后成液體狀態(tài)培養基。常用于生理代謝的研究和工業(yè)發(fā)酵等。 

 

LB（Luria-Bertani）培養基是一種應用最廣泛和最普通的細菌基礎培養基，有時(shí)又稱(chēng)為普通培養基。它含有酵母提取物、蛋白胨和NaCl。其中酵母提取物為微生物提供碳源和能源，磷酸鹽、蛋白胨主要提供氮源，而NaCl提供無(wú)機鹽。在配制固體培養基時(shí)還要加入一定量瓊脂作凝固劑。瓊脂在常用濃度下96℃時(shí)溶化，一般實(shí)際應用時(shí)在沸水浴中或下面墊以石棉網(wǎng)煮沸溶化，以免瓊脂燒焦。瓊脂在40℃時(shí)凝固，通常不被微生物分解利用。固體培養基中瓊脂的含量根據瓊脂的質(zhì)量和氣溫的不同而有所不同。由于這種培養基多用于培養細菌，因此，要用稀酸或稀堿將其pH調至中性或微堿性，以利于細菌的生長(cháng)繁殖。 

 

實(shí)驗材料： 

[1].大腸桿菌菌株：DH5α 

[2].酵母提取物（Yeast extract） 

[3].蛋白胨（Tryptone） 

[4].NaCl 

[5].瓊脂 (agar) 

[6].1M NaOH 

[7].1M HCl 

[8].0.1M CaCl2：在100ml純水中溶解2.8gCaCl2.6H2O，用0.22μm濾器過(guò)濾除菌，分裝成10ml小份，-20℃凍存。 

[9].37℃培養箱、試管，三角燒瓶，燒杯，培養皿（9cm），量筒，玻棒，培養基分裝器，天平，牛角匙，高壓蒸汽滅菌鍋，pH試紙（pH5.5~9.0），棉花，牛皮紙，記號筆，麻繩等。 

 

實(shí)驗步驟： 

1、LB培養基的準備 

[1].稱(chēng)量：準確地稱(chēng)取酵母提取物5g、蛋白胨10g、NaCl 10g，放入燒杯中。蛋白胨很易吸潮，在稱(chēng)取時(shí)動(dòng)作要迅速。 

[2].溶化：加入800ml ddH2O，用磁力攪拌子攪拌溶解。 

[3].調pH：先用精密pH試紙測量培養基的原始pH值，如果pH偏酸，用1M NaOH調節pH達7.0。反之，則用1M HCl進(jìn)行調節。注意pH值不要調過(guò)頭，以避免回調，否則，將會(huì )影響培養基內各離子的濃度。pH調節好之后，用ddH2O定容到1000ml。如果要配制固體LB培養基，1000ml液體培養基加入15 g瓊脂。 

[4].分裝：按實(shí)驗要求，將液體培養基分裝入試管內或三角燒瓶?jì)�。分裝過(guò)程中注意不要使培養基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。液體分裝高度以試管高度的1/4左右為宜。固體分裝試管，其裝量不超過(guò)管高的1/5，滅菌后制成斜面，分裝三角燒瓶的量以不超過(guò)三角燒瓶容積的一半為宜。半固體分裝試管一般以試管高度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝。 

[5].加塞：培養基分裝完畢后，在試管口或三角燒瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物進(jìn)入培養基內而造成污染，并保證有良好的通氣性能。 

[6].包扎：加塞后，將全部試管用麻繩捆扎好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時(shí)冷凝水潤濕棉塞，其外再用一道麻繩扎好。用記號筆注明培養基名稱(chēng)、組別、日期。三角燒瓶加塞后，外包牛皮紙，用麻繩以活結形式扎好，使用時(shí)容易解開(kāi)，同樣用記號筆注明培養基名稱(chēng)、組別、日期。 

[7].滅菌：將上述培養基以0.1~0.165 MPa (120~130)℃高壓蒸汽滅菌20min。如因特殊情況不能及時(shí)滅菌，則應放入冰箱內暫存。 

[8].擱置斜面：將滅菌的試管培養基冷至50℃左右，將試管棉塞端擱在玻棒上，擱置的斜面長(cháng)度以不超過(guò)試管總長(cháng)的一半為宜。