細菌的轉化與平板篩選

 

 感受態(tài)是指細菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)。轉化是指質(zhì)粒DNA或以它為載體構建的重組子導人細菌的過(guò)程。其原理是細菌處于0℃，CaCl₂低滲溶液中，菌細胞膨脹成球形。轉化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基—鈣磷酸復合物粘附于細胞表面，經(jīng)42℃短時(shí)間熱擊處理，促進(jìn)細胞吸收DNA復合物。將細菌放置在非選擇性培養基中保溫一段時(shí)間，促使在轉化過(guò)程中獲得的新的表型(如Amp^r等)得到表達，然后將此細菌培養物涂在含有氨芐青霉素的選擇性培養基上。

 

重組質(zhì)粒轉化宿主細胞后，還需對轉化菌落進(jìn)行篩選鑒定。利用α互補現象進(jìn)行篩選是最常用的一種鑒定方法�，F在使用的許多載體都具有一段大腸桿菌β半乳糖苷酶的啟動(dòng)子及其編碼α肽鏈的DNA序列，此結構稱(chēng)為lacZ'基因。lacZ'基因編碼的α肽鏈是β半乳糖苷酶的氨基端的短片段(146個(gè)氨基酸)。任何攜帶著(zhù)lacZ'基因的質(zhì)粒載體轉化了染色體基因組存在著(zhù)此種β半乳糖苷酶突變的大腸桿菌細胞后，便會(huì )產(chǎn)生出有功能活性的半乳糖苷酶，在IPTG(異丙基β—D—硫代半乳糖苷)誘導后，在含有Xgal(5-溴-4-氯-3-吲哚-6-D-半乳糖苷)的培養基平板上形成藍色菌落（半乳糖苷酶能將無(wú)色的化合物Xgal切割成半乳糖和深藍色的底物5-溴-4-靛藍）。而當有外源DNA片段插入到位于lacZ'中的多克隆位點(diǎn)后，就會(huì )破壞α肽鏈的閱讀框，從而不能合成與受體菌內突變的β半乳糖苷酶相互補的活性α肽，而導致不能形成有功能活性的β半乳糖苷酶，也就不能分解Xgal而顯藍色，因此含有重組質(zhì)粒載體的克隆往往是白色菌落。

 

  超凈工作臺、低溫離心機、恒溫搖床、恒溫箱、恒溫水浴、離心管、試管、培養皿、錐形瓶、接種針、玻璃涂棒、酒精燈、鑷子、牙簽、大腸桿菌DH5a 、質(zhì)粒

 

0.1mol／L CaCl₂溶液 LB液體培養基 LB固體培養基 

氨芐青霉素(Amp)：用無(wú)菌水配制成100mg／mL溶液，置—20℃冰箱保存。

Xgal：將Xgal溶于二甲基甲酰胺，配成20mg／mL，不需過(guò)濾滅菌，分裝小包裝，避光貯存于-20℃。

IPTG：取2g IPTG溶于8mL雙蒸水中，再用雙蒸水補至10mL，用0.22um濾膜過(guò)濾除菌，每份1mL，貯存于-20℃。

 

(一) 制備感受態(tài)細胞

1、吸取15µl E.coil菌液，接種于20ml LB液體培養基中，37℃振蕩培養過(guò)夜，待OD₆₀₀=0.5左右將該菌懸液以1：50接種量轉于50ml LB液體培養基中，37℃振蕩擴大培養，當培養液開(kāi)始出現混濁后，每隔20-30min測一次OD₆₀₀，至OD₆₀₀=0.6左右，停止培養。

2、培養液轉入離心管中，在冰浴10min，4℃下5000rpm離心10min。

3、棄上清液，用4ml冰預冷的0.1M CaCl₂溶液輕輕懸浮菌體至均勻，冰上放置30min。

4、4℃下5000rpm離心6min。

5、棄上清液，用2ml冰預冷的0.1M CaCl₂溶液輕輕懸浮菌體至均勻，冰上放置片刻后即制成感受態(tài)細胞懸液。

6、以上制好的感受態(tài)細胞懸液可在冰上放置，24小時(shí)內直接用于轉化實(shí)驗，也可加入15%高壓滅菌過(guò)的甘油，混勻后，分裝于1.5ml離心管中，每管100µ l感受態(tài)細胞懸液，置-70℃條件下保存。.

(二) 質(zhì)粒DNA轉化大腸桿菌

1、取100µl搖勻后的感受態(tài)細胞懸浮液（如是冷凍保存液，則需化凍后馬上進(jìn)行下面的操作），加入5µl連接產(chǎn)物，輕輕搖勻，冰上放置30min后，于42 IPTG水浴中保溫90s，然后迅速在冰上冷卻2min。

2、加入900µl LB液體培養基，則總體積約1ml，混勻于37℃振蕩培養90分鐘使受體菌恢復正常生長(cháng)狀態(tài)并使轉化體產(chǎn)生抗藥性Amp^r。

 3、在預制的LB瓊脂平板上，加40uL 20mg／mL的Xgal和4uL 200mg／mL的IPTG溶液，并用滅菌玻璃推子(酒精燈上燒后冷卻)，均勻涂布于瓊脂凝膠表面，37℃倒置吸收。

4、將恢復培養的菌體4000rpm離心5min，移去上層900µl LB培養基，用余下的100µl重懸菌體至均勻。

(四) α互補現象的檢查

將重懸菌體均勻涂布于含X-gal+IPTG+氨芐青霉素的LB平板上，37℃倒置培養12—24h，出現菌落。其中白色菌落從理論上講為重組克隆。

如果進(jìn)一步驗證，可挑取多個(gè)白色菌落分別接種到1ml含有氨芐青霉素的LB液體培養基中，37℃振蕩培養6-8h，然后提取質(zhì)粒酶切驗證，或進(jìn)行菌落PCR擴增鑒定。