基因工程菌株的培養與觀(guān)察

 

大腸桿菌是含有長(cháng)約3000Kb的環(huán)狀染色體的棒狀細菌，它能在僅含碳水化合物（如葡萄糖，提供碳源和能量）和提供氮、磷、微量元素的無(wú)機鹽的極限培養基上快速生長(cháng)。如果用含氨基酸、核苷酸前體、維生素以及其它一些細菌不能合成的代謝成分的豐富培養基來(lái)培養，那么大腸桿菌會(huì )生長(cháng)的更快。大多數應用于DNA重組技術(shù)的細菌是大腸桿菌K-12株的衍生菌株。

 

當大腸桿菌在液體培養基中培養時(shí)，其開(kāi)始裂殖前，先進(jìn)入一個(gè)生長(cháng)滯后期。在豐富培養基中，它能在20-30min內復制一代，這種指數生長(cháng)相稱(chēng)之為對數期。最后，當培養基中的營(yíng)養成分和氧耗盡或當培養基中廢物的含量達到抑制細菌的快速生長(cháng)的濃度時(shí)，菌體密度就達到一個(gè)比較恒定的值。在通常的實(shí)驗室培養中，在這一時(shí)期的細胞密度一般為1*10⁹—2*10⁹ml，細胞停止迅速分裂。這就是細菌生長(cháng)的飽和期，而所謂的新鮮飽和即指當培養液中細胞密度剛到達這一水平。

 

培養特征是指微生物在培養基上所表現的群體形態(tài)和生長(cháng)情況。細菌培養特征的常規檢驗包括平面上的菌落特征，液體培養時(shí)的生長(cháng)特征以及斜面培養上的菌苔特征。菌落是個(gè)體微生物在固體培養基上生長(cháng)繁殖成的肉眼可見(jiàn)的群落。在一定的培養條件下，不同的細菌形成的菌落形狀是不一樣的。

 

超凈工作臺酒精燈無(wú)菌培養皿及試管 接種環(huán) 無(wú)菌牙簽 涂布棒DH5α菌株

LB液體培養基：每升含10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g NaCL、1mL 1M NaOH

LB固體培養基：每升含10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、5g NaCL、1mL 1M NaOH、15g瓊脂糖

（一）在固體培養基中培養

將已熔化的LB固體培養基冷涼到50℃左右（即熱而不燙手），按無(wú)菌操作倒入無(wú)菌培養皿內，冷卻凝固成平板，將涂布棒的三角部分浸沒(méi)于酒精中，取出后再通過(guò)燈焰，點(diǎn)燃其上的乙醇，待涂布棒上的火焰熄滅后，將其觸碰無(wú)菌瓊脂平板的表面使其冷卻。然后，取少許菌液（100uL）滴在平板上，用涂布棒作圓周運動(dòng)將菌液涂布均勻，待平板干后于37℃倒置培養過(guò)夜。待菌落長(cháng)出后，觀(guān)察菌落特征

（二）在液體培養基中培養

取5mL液體培養基加入一支無(wú)菌試管中，用無(wú)菌牙簽挑一個(gè)單菌落浸沒(méi)于培養液中并輕輕振動(dòng)，使待接種的細菌分散在培養液中，蓋好試管，在搖床上以60r/min于37℃培養至飽和（約6h），觀(guān)察液體培養物是否混濁。利用分光光度計監測，按每0.1 OD值大約相當于10⁸細胞/mL計算細菌濃度。