培養基的制備與滅菌

 

（1） 熟悉玻璃器皿的洗滌包裝和滅菌前的準備工作。

（2） 學(xué)習微生物培養基和無(wú)菌水的制備，了解培養基配方中各成分的作用、制備流程及各環(huán)節的操作技術(shù)與應用。

（3） 學(xué)習并掌握培養基的高壓蒸氣滅菌原理、操作關(guān)鍵技術(shù)和滅菌技術(shù)。

培養基是按照微生物生長(cháng)發(fā)育的需要，用不同組分的營(yíng)養物質(zhì)調制而成的營(yíng)養基質(zhì)。人工制備培養基的目的，在于給微生物創(chuàng )造一個(gè)良好的營(yíng)養條件。把一定的培養基放入一定的器皿中，就提供了人工繁殖微生物的環(huán)境和場(chǎng)所。自然界中，微生物種類(lèi)繁多，由于微生物具有不同的營(yíng)養類(lèi)型，對營(yíng)養物質(zhì)的要求也各不相同，加之實(shí)驗和研究上的目的不同，所以培養基在組成原料上也各有差異。但是，不同種類(lèi)和不同組成的培養基中，均應含有滿(mǎn)足微生物生長(cháng)發(fā)育的水分、碳源、氮源、無(wú)機鹽和生長(cháng)素以及某些特需的微量元素等。此外，培養基還應具有適宜的酸堿度(pH值)和一定緩沖能力及一定的氧化還原電位和合適的滲透壓。

 

根據制備培養基對所選用的營(yíng)養物質(zhì)的來(lái)源，可將培養基分為天然培養基、半合成培養基和合成培養基三類(lèi)。按照培養基的形態(tài)可將培養基分為液體培養基和固體培養基。根據培養基使用目的，可將培養基分為選擇培養基、加富培養基及鑒別培養基等。

培養基的類(lèi)型和種類(lèi)是多種多樣的，必須根據不同的微生物和不同的目的進(jìn)行選擇配制，本實(shí)驗分別配制常用培養細菌、放線(xiàn)菌和真菌的牛肉膏蛋白胨培養基、高氏一號合成培養基和馬鈴薯蔗糖培養基等固體培養基。

 

固體培養基是在液體培養基中添加凝固劑制成的，常用的凝固劑有瓊脂、明膠和硅酸鈉，其中以瓊脂最為常用，其主要成份為多糖類(lèi)物質(zhì)，性質(zhì)較穩定，一般微生物不能分解，故用凝固劑而不致引起化學(xué)成份變化。瓊脂在95℃的熱水中才開(kāi)始融化，融化后的瓊脂冷卻到45℃才重新凝固。因此用瓊脂制成的固體培養基在一般微生物的培養溫度范圍內(25℃-37℃)不會(huì )融化而保持固體狀態(tài)。

 

高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個(gè)密閉的加壓滅菌鍋內，通過(guò)加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽。待水蒸汽急劇地將鍋內的冷空氣從排氣閥中驅盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續加熱，此時(shí)由于蒸汽不能溢出，而增加了滅菌器內的壓力，從而使沸點(diǎn)增高，得到高于100℃的溫度。導致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達到滅菌的目的。

 

在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，其原因有三：一是濕熱中細菌菌體吸收水分，蛋白質(zhì)較易凝固，因蛋白質(zhì)含水量增加，所需凝固溫度降低(表Ⅴ-2)，二是濕熱的穿透力比干熱大(表Ⅴ-3)；三是濕熱的蒸汽有潛熱存在，每1克水在100℃時(shí)，由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時(shí)可放出2.26kJ(千焦)的熱量。這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。

 

表Ⅴ-2 蛋白質(zhì)含水量與凝固所需溫度的關(guān)系

 

 

表Ⅴ-3 干熱與濕熱穿透力及滅菌效果比較 

 

 

在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時(shí)，滅菌鍋內冷空氣的排除是否完全極為重要，因為空氣膨脹壓大于水蒸汽的膨脹壓，所以，當水蒸汽中含有空氣時(shí)，在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。滅菌鍋內留有不同分量空氣時(shí)，壓力與溫度的關(guān)系見(jiàn)表Ⅴ-4。一般培養基用1.05kg/cm²，121.3℃ 15-30分鐘可達到徹底滅菌的目的。滅菌的溫度及維持的時(shí)間隨滅菌物品的性質(zhì)和容量等具體情況而有所改變。例如含糖培養基用0.56kg/cm²(8磅/英寸²)，112.6℃滅菌15分鐘，但為了保證效果，可將其他成分先行121.3℃，20分鐘滅菌，然后以無(wú)菌操作手續加入滅菌的糖溶液。又如盛于試管內的培養基以1.05kg/cm²，121.3℃滅菌20分鐘即可，而盛于大瓶?jì)鹊呐囵B基最好以1.05kg/cm²滅菌30分鐘。

 

表Ⅴ-4滅菌鍋內留有不同分量空氣時(shí)，壓力與溫度的關(guān)系  

 

蒸汽壓力所用單位為kg/cm²(千克/厘米²)，它與1b/in²(磅/英寸²)和溫度的換算關(guān)系見(jiàn)表Ⅴ-5。

 

表Ⅴ-5 蒸汽壓力與蒸汽溫度換算關(guān)系 

 

三、實(shí)驗器材

1、 藥品瓊脂，10％HCL,10% NaOH，牛肉膏蛋白胨培養基的配方藥品；

2、 材料具刻度1000毫升塘瓷盅或小鋁鍋，電子稱(chēng)，10×200mm試管，量筒，小燒杯，玻璃棒，骨匙，pH試紙，分裝漏斗，試管盒，紗布，棉花，報紙，麻繩，標簽，培養皿。

3、 設備高壓蒸汽滅菌鍋、烘箱、冰箱、電爐等

 

四、實(shí)驗步驟

1、 稱(chēng)取藥品放在大燒杯中，加入蒸餾水用玻璃棒攪拌并加熱溶化，等藥品溶解后用pH試紙調節p H至7.4-7.6，如有沉淀應過(guò)濾后分裝，每支試管約加入9ml。每組分裝30支，加上棉塞，包上牛皮紙，準備滅菌。

2、無(wú)菌水準備

在試管或瓶?jì)认仁⒁赃m量的蒸餾水〔或生理鹽水O．85％NaCl)，蓋好棉塞，包上牛皮紙使其滅菌后，其水量恰為9ml。 每組準備10支與牛肉膏蛋白胨培養基可放在同一試管架上，以一大張牛皮紙包扎寫(xiě)上姓名。準備滅菌。

3、高壓滅菌

手提式高壓蒸汽滅菌鍋的使用操作步驟：

（1）首先將內層滅菌桶取出，再向外層鍋內加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。

（2）放回滅菌桶，并裝入待滅菌物品。注意不要裝得太擠，以免防礙蒸汽流通而影響滅菌效果。三角燒瓶與試管口端均不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。

（3）加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內層滅菌桶的排氣槽內。再以?xún)蓛蓪ΨQ(chēng)的方式同時(shí)旋緊相對的兩個(gè)螺栓，使螺栓松緊一致，勿使漏氣。

（4）用電爐或煤氣加熱，并同時(shí)打開(kāi)排氣閥，使水沸騰以排除渦內的冷空氣。待冷空氣完全排盡后，關(guān)上排氣閥，讓鍋內的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升。當鍋內壓力升到所需壓力時(shí)，控制熱源，維持壓力至所需時(shí)間。本實(shí)驗用1.05kg/cm²，121.3℃，20分鐘滅菌。

（5）滅菌所需時(shí)間到后，切斷電源或關(guān)閉煤氣，讓滅菌鍋內溫度自然下降，當壓力表的壓力降至0時(shí)，打開(kāi)排氣閥，旋松螺栓，打開(kāi)蓋子，取出滅菌物品。如果壓力未降到0時(shí)，打開(kāi)排氣閥，就會(huì )因鍋內壓力突然下降，使容器內的培養基由于內外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養基而發(fā)生污染。

（6）將取出的滅菌培養基放入37℃溫箱培養24小時(shí)，經(jīng)檢查若無(wú)雜菌生長(cháng)，即可待用。