土壤微生物分離與純化實(shí)驗原理和方法

 

一、實(shí)驗目的 

了解血球計數板的構造、計數原理和計數方法，掌握顯微鏡下直接計數的技能。

 

二、實(shí)驗原理 

測定微生物細胞數量的方法很多，通常采用的有顯微直接計數法和平板計數法。

 

顯微計數法適用于各種含單細胞菌體的純培養懸浮液，如有雜菌或雜質(zhì)，常不易分辨。菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計數板，一般細菌則采用彼得羅夫· 霍澤（Petrof Hausser）細菌計數板。兩種計數板的原理和部件相同，只是細菌計數板較薄，可以使用油鏡觀(guān)察。而血球計數板較厚，不能使用油鏡，計數板下部的細菌不易看清。

 

血球計數板是一塊特制的厚型載玻片，載玻片上有4條槽而構成3個(gè)平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個(gè)半邊上面各有一個(gè)計數區，計數區的刻度有兩種：一種是計數區分為16個(gè)大方格（大方格用三線(xiàn)隔開(kāi)），而每個(gè)大方格又分成25個(gè)小方格；另一種是一個(gè)計數區分成25個(gè)大方格（大方格之間用雙線(xiàn)分開(kāi)），而每個(gè)大方格又分成16個(gè)小方格。但是不管計數區是哪一種構造，它們都有一個(gè)共同特點(diǎn)，即計數區都由400個(gè)小方格組成。

 

計數區邊長(cháng)為1mm，則計數區的面積為l mm2，每個(gè)小方格的面積為1/400mm2。蓋上蓋玻片后，計數區的高度為0.1mm，所以每個(gè)計數區的體積為0.1mm3，每個(gè)小方格的體積為1 /4000mm3。

   

 

  

使用血球計數板計數時(shí)，先要測定每個(gè)小方格中微生物的數量，再換算成每毫升菌液（或每克樣品）中微生物細胞的數量。 

已知：1mm3體積=10 mm×10 mm×10 mm= 1000mm3 

所以：1mm3體積應含有小方格數為1000mm3/1/4000mm3=4×106個(gè)小方格，即系數K=4×106 。 

因此：每ml菌懸液中含有細胞數= 每個(gè)小格中細胞平均數（N）×系數（K）×菌液稀釋倍數（d）

 

1．活材料：釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）斜面或培養液。 

2．器材：顯微鏡、血球計數板、蓋玻片（22mm×22mm）、吸水紙、計數器、滴管、擦鏡紙。

 

四、實(shí)驗方法   

1．視待測菌懸液濃度，加無(wú)菌水適當稀釋?zhuān)ㄐ泵嬉话阆♂尩?0-2），以每小格的菌數可數為度。 

2．取潔凈的血球計數板一塊，在計數區上蓋上一塊蓋玻片。 

3．將酵母菌懸液搖勻，用滴管吸取少許，從計數板中間平臺兩側的溝槽內沿蓋玻片的下邊緣摘入一小滴（不宜過(guò)多），讓菌懸液利用液體的表面張力充滿(mǎn)計數區，勿使氣泡產(chǎn)生，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌懸液。也可以將菌懸液直接滴加在計數區上，不要使計數區兩邊平臺沾上菌懸液，以免加蓋蓋玻片后，造成計數區深度的升高。然后加蓋蓋玻片（勿使產(chǎn)生氣泡）。 

4．靜置片刻，將血球計數板置載物臺上夾穩，先在低倍鏡下找到計數區后，再轉換高倍鏡觀(guān)察并計數。由于生活細胞的折光率和水的折光率相近，觀(guān)察時(shí)應減弱光照的強度。 

5．計數時(shí)若計數區是由16個(gè)大方格組成，按對角線(xiàn)方位，數左上、左下、右上、右下的4個(gè)大方格（即100小格）的菌數。如果是25個(gè)大方格組成的計數區，除數上述四個(gè)大方格外，還需數中央l個(gè)大方格的菌數（即80個(gè)小格）。如菌體位于大方格的雙線(xiàn)上，計數時(shí)則數上線(xiàn)不數下線(xiàn)，數左線(xiàn)不數右線(xiàn)，以減少誤差。 

6．對于出芽的酵母菌，芽體達到母細胞大小一半時(shí)，即可作為兩個(gè)菌體計算。每個(gè)樣品重復計數2—3次（每次數值不應相差過(guò)大，否則應重新操作），求出每一個(gè)小格中細胞平均數（N），按公式計算出每ml（g）菌懸液所含酵母菌細胞數量。