微生物細胞的顯微直接計數法

 

了解血球計數板的構造、計數原理和計數方法，用顯微鏡直接測定微生物總細胞數。

 

測定微生物細胞數量的方法很多，通常采用的有顯微直接計數法和稀釋平板計數法。

 

直接計數法適用于各種單細胞菌體的純培養懸浮液，如有雜菌或雜質(zhì)，則難于直接測定。菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計數板，一般細菌則采用彼得羅夫·霍澤(Petrof Hausser)細菌計數板。兩種計數板的原理和部件相同、只是細菌計數板較薄，可以使用油鏡觀(guān)察。而血球計數板較厚，不能使用油鏡，計數板下部的細菌難于區分。

 

血球汁數板是一塊特制的厚型載玻片，載玻片上有4條槽所構成的3個(gè)平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個(gè)半邊上面各有一個(gè)計數區，計數區的刻度應有兩種：一種是計數區分為16個(gè)大方格(大方格用三線(xiàn)隔開(kāi))，而每個(gè)大方格又分成25個(gè)小方格；另一種是一個(gè)計數區分成25個(gè)大方格(大方格之間用雙線(xiàn)分開(kāi))，而每個(gè)大方格又分成16個(gè)小方格。但是不管計數區是哪一種構造，它們都有一個(gè)共同特點(diǎn)，即計數區都由400個(gè)小方格組成。

 

計數區邊長(cháng)為1mm，則計數區的面積為1mm²，每個(gè)小方格的面積為1/400mm²。蓋上蓋玻片后，計數區的高度為0.1mm，所以計數區的體積為0.1mm³，每個(gè)小方格的體積為1／4000mm³。

 

使用血球計數板計數時(shí)，先要測定每個(gè)小方格中微生物的數量，再換算成每mL菌液(或每g樣品)中微生物細胞的數量。

已知：1mL體積＝10mm×10mm×10mm＝1000mm³

 

所以：1mL體積應含有小方格數為1000mm³／(1／4000mm³)＝4x10⁶個(gè)小方格。即系數K＝4x10⁶。因此：每mL菌懸液中含有細胞數=每個(gè)小格中細胞平均數(N) x系數(K) x菌液稀釋倍數(d)。

 

(1)活材料：釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae )斜面菌種或培養液。

 

(2)器材：顯微鏡、血球計數板、蓋玻片(22mm x 22mm)、吸水紙、計數器、滴管、擦鏡紙。

 

 

(1)視待測菌懸液濃度，加無(wú)菌水適量稀釋(斜面一般稀釋到10^-2)，以每小格的菌數可數為度。

 

(2)取潔凈的血球計數板一塊，在計數區上蓋上一塊蓋玻片。

 

(3)將酵母菌懸液搖勻，用滴管吸取少許，從計數板中間平臺兩側的溝槽內沿蓋玻片的下邊緣滴入一小滴(不宜過(guò)多)，讓菌懸液利用液體的表面張力充滿(mǎn)計數區，勿使氣泡產(chǎn)生，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌懸液。也可以將菌懸液直接滴加在計數區上，注意不要使計數區兩邊平臺沾上菌懸液，以免加蓋蓋玻片后，造成計數區深度的升高。然后加蓋蓋玻片(勿使產(chǎn)生氣泡)。

 

(4)靜置片刻，將血球計數板置載物臺上夾穩，先在低倍鏡下觀(guān)察到計數區后，再轉換高倍鏡觀(guān)察并計數。由于活細胞的折光率和水的折光率相近，觀(guān)察時(shí)應適當關(guān)小孔徑光闌并減弱光照的強度。

 

(5)計數時(shí)若計數區是由16個(gè)大方格組成，按對角線(xiàn)方位，數左上、左下、右上、右下的4個(gè)大方格(即100小格)的菌數。如果是25個(gè)大方格組成的計數區．除數上述四個(gè)大方格外，還需數中央1個(gè)大方格的菌數(即80個(gè)小格)。如菌體位于大方格的雙線(xiàn)上，計數時(shí)則數上線(xiàn)不數下線(xiàn)，數左線(xiàn)不數右線(xiàn)，以減少誤差。

 

(6)對于出芽的酵母菌，芽體達到母細胞大小一半時(shí)，即可作為兩個(gè)菌體計算。每個(gè)樣品重復計數2—3次(每次數值不應相差過(guò)大，否則應重新操作)，求出每一個(gè)小格中細胞平均數(N)，按公式計算出每mL(g)菌懸液所含酵母菌細胞數量。

 

(7)測數完畢，取下蓋玻片，用水將血球計數板沖洗干凈，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免損壞網(wǎng)格刻度。洗凈后自行晾干或用吹風(fēng)機吹干，放入盒內保存。