環(huán)境中微生物的觀(guān)察及從土壤中分離純化微生物

 

1.實(shí)驗目的和要求 

 

（1）通過(guò)對周?chē)�環(huán)境中微生物的觀(guān)察，理解無(wú)菌操作原理，了解微生物的普遍存在性。

（2）通過(guò)從土壤中分離純化微生物，掌握無(wú)菌操作技術(shù)。

 

2.實(shí)驗材料和儀器

 

2.1配制肉湯蛋白胨固體培養基平板（每組15個(gè)）

 

（1）牛肉膏5g；

（2）蛋白胨10g；

（3）NaCl 5g；

（4）瓊脂20g；

（5）自來(lái)水1000mL pH 7.5，0.1MPa，121℃來(lái)菌20min。

 

2.2無(wú)菌生理鹽水

 

（1）250mL三角瓶中加入99mL 0.9% NaCl （加20個(gè)左右的玻璃珠）；

（2）250mL三角瓶中加入50mL 0.9% NaCl （作10倍稀釋用）。

 

2.3儀器及器皿

 

（1）帶螺帽試管5支；

（2）牙簽2支；

（3）5mL及1mL吸頭2支；

（4）涂布棒2支；

（5）5mL及1mL取液器各一支；

（6）30℃和37℃培養箱；

（7）接種環(huán)、酒精燈和火柴；

（8）搖床。

 

（1）-（4）要求事先滅菌。

 

3.實(shí)驗方法和步驟

3.1從土壤中分離和純化微生物

 

（1）采土樣

     選擇較肥沃的土壤，鏟去表土層，挖5-20cm深度的或特殊要求的地方土壤數10g，裝入滅過(guò)菌的牛皮紙袋內，封好袋口，做好編號記錄，攜回實(shí)驗室供分離用。

 

（2）制備土壤稀釋液

     稱(chēng)取土樣1.0g放入盛99mL無(wú)菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中，置搖床振蕩5min使土樣均勻分散在稀釋液中成為土壤懸液（10-2）。用1mL的無(wú)菌吸頭從中吸取0.5mL土壤懸液注入盛有4.5mL無(wú)菌水的試管中，吹吸3次，振蕩混勻（10-3）。然后再用同一支1mL吸頭，從此管中吸取0.5mL注入另一盛有4.5mL無(wú)菌水的試管中（10-4），依此類(lèi)推制成10-5，10-6，10-7各種稀釋度的土壤溶液。

 

3.2涂布

   用一支1mL無(wú)菌吸頭分別從稀釋度10-7、10-6和10-5的土壤稀釋液中各吸取0.1mL對號放入已寫(xiě)好稀釋度的肉湯蛋白胨培養基平板上，用無(wú)菌玻璃涂棒在培養基表面輕輕地涂布均勻。涂布時(shí)從低濃度到高濃度分別在培養基表面輕輕地涂布，可轉動(dòng)皿底一定角度，繼續涂布，直至均勻。每個(gè)濃度做3個(gè)平板。

 

3.3培養

   將平板倒置于37℃溫箱中培養48h。統計每個(gè)平板長(cháng)出的平均菌落數。根據下面菌落計數方法，算出每克土壤中的細菌含量。

 

3.4菌落計數方法

   先計算相同稀釋度的平均菌落數。若其中一個(gè)培養皿有較大片菌苔生長(cháng)時(shí)，則不應使用，而應以無(wú)片狀菌苔生長(cháng)的平皿作為該稀釋度的平均菌落數。若片狀菌苔的大小不到培養皿的一半，而其余的一半菌落分布又很均勻時(shí)，可將此一半的菌落數乘2以代表全部平皿的菌落數，然后再計算該稀釋度的平均菌落數。

   首先選擇平均菌落數為30～300的平板，當只有一個(gè)稀釋度的平均菌落數符合此范圍時(shí)，則以該平均菌落數乘以其稀釋倍數即為該樣品中的微生物總數。

   若有兩個(gè)稀釋度的平均菌落數為30～300，則按兩者菌落總數之比值來(lái)決定。若其比值小于2，應采取兩者的平均數:

   若大于2，則取其中較少的菌落總數。

   若所有稀釋度的平均菌落數均大于300，則應按稀釋度最高的平均菌落數乘以稀釋倍數。

   若所有稀釋度的平均菌落數均小于30，則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數。

   若所有稀釋度的平均菌落數均不在30～300之間，則以最接近30或300的平均菌落數乘以稀釋倍數。