一． 實(shí)驗目的
1 ．以 pGLO 質(zhì)粒轉化大腸桿菌為例，學(xué)習轉化的基本原理及方法。
2 ．驗證 DNA 是遺傳物質(zhì)，加深對中心法則的理解。
二．實(shí)驗原理
轉化（ transformation ）是指一段同源或異源的 DNA 轉入受體細胞并得到表達的水平基因的轉移過(guò)程，是現代分子生物學(xué)研究和基因工程不可缺少的重要技術(shù)。目前常用的轉化方法有 CaCl 2 法 ( 化學(xué)轉化法 ) 和電轉化法。本實(shí)驗是用 pGLO 細菌轉化試劑盒中提供的 pGLO 質(zhì)粒來(lái)轉化大腸桿菌，所用方法為 CaCl 2 轉化法。
pGLO 質(zhì)粒：
pGLO 質(zhì)粒上主要含有兩個(gè)基因，一個(gè)為編碼綠色熒光蛋白 (GFP) 的基因，一個(gè)為抗生素氨芐青霉素抗性基因。此外，該質(zhì)粒還整合有一個(gè)特殊的參與受體細胞中綠色熒光蛋白表達的基因調控體系，轉化細胞中的綠色熒光蛋白基因只有在培養基中存在阿拉伯糖時(shí)才能啟動(dòng)表達。轉化子細胞將在不含阿拉伯糖的培養基上呈白色而在含阿拉伯糖的培養基上顯綠色熒光，這種熒光在長(cháng)波紫外燈下即可觀(guān)察到。
三． 實(shí)驗材料 受體菌： E.coli K12 HB101
質(zhì)粒： pGLO plasmid
轉化液（ CaCl2 ）
氨芐青霉素（ amp ）
阿拉伯糖（ ara ）
培養基：固體 LB 、液體 LB
接種環(huán)、移液器等
四． 實(shí)驗步驟
1. 準備平板： 每組： 1 塊 LB 平板， 2 塊 LB/amp 平板， 1 塊 LB/amp/ara 平板
2. 準備感受態(tài)細胞：用 250 μ l 無(wú)菌水或轉化液懸浮試劑盒中提供的大腸桿菌菌粉，此即感受態(tài)細胞。
3. 活化受體細胞：挑取 1 環(huán) E.coli K12 HB101 菌液，于 LB 培養基上 37 ℃ 活化 16-24h 。
4. 轉化：
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1） 在兩只無(wú)菌離心管上分別標
記 +DNA, -DNA 。 |
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2） 在上述兩管中分別加入
250 μ l 轉化液。 |
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3) 迅速置于冰上。 |
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4） 各挑取活化好的受體菌的一
個(gè)單菌落，懸浮于兩管轉化液中。 |
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5） 在標有 +DNA 的管中加入一
環(huán)質(zhì)粒 DNA ，而標有 -DNA 的管中不加。 |
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6） 將上述兩管于冰上放置 10min 。 |
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7） 在準備好的培養基底部如左圖。 |
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8 ）兩只小管放入 42 ℃ 水浴中處理 50 秒，再迅速放于冰上 2 min 。 |
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9 ）在兩只小管中分別加入 250 μ l LB- 肉湯。 |
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10 ）從 +DNA 小管中分別吸取 100 μ l 滴加在兩個(gè)標有 +DNA 的平板上，從 -DNA 小管中分別吸取 100 μ l 滴加在兩個(gè)標有 -DNA 的平板上。
11 ）用無(wú)菌接種環(huán)將滴加的液體均勻涂布在平板上。 |
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12 ）將上述四只平板固定，并于 42 ℃ 培養箱中培養 2 天。
13 ）在長(cháng)波紫外燈下觀(guān)察結果，記錄各平板上的菌落數 |
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