培養基的制備

    1、了解人工培養基的主要成分及一般制備原則。

　　2、掌握基礎培養基的制造方法和過(guò)程。

    培養基是人工配制的適合微生物生長(cháng)繁殖的營(yíng)養基質(zhì)。培養基要具備以下條件：①要有適宜的營(yíng)養物質(zhì)和水分；②具有適宜的PH值；③配制后應經(jīng)滅菌呈無(wú)菌狀態(tài)。

    培養基按物理狀態(tài)可分液體培養基、固體培養基、半固體培養基。常用瓊脂作凝固劑。

    培養基制備的基本程序：配料、溶化、測定及矯正PH、過(guò)濾、分裝、滅菌、無(wú)菌檢驗

    試管、刻度吸管、紗布、濾紙、三角瓶、培養皿、量筒、漏斗、棉塞、電爐、天平、包裝紙、棉線(xiàn)、ph試紙、玻棒。試劑：牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、磷酸氫二鉀、瓊脂條、0.1mol/L和1mol/L氫氧化鈉、0.1mol/L和1mol/L的鹽酸溶液、蒸餾水等。

    一、配制原則和種類(lèi)

    （一）培養基配制原則

    1、培養基：培養基是提供食用菌等生物生長(cháng)發(fā)育所需的營(yíng)養與特定環(huán)境條件的基質(zhì)，如蘑菇菌是有機營(yíng)養型中的草腐生菌。制備培養基不僅要考慮它所需要的含碳化合物、含氮化合物、礦物鹽類(lèi)、生長(cháng)因子，還要考慮水與pH環(huán)境，同時(shí)還應考慮它們培養方式是固體培養還是液體培養。因此，可以把按菌類(lèi)生長(cháng)發(fā)育需要比例配制的滅菌營(yíng)養基質(zhì)，稱(chēng)為培養基。換言之，培養基必須具備三個(gè)條件：含有菌株生長(cháng)發(fā)育所需要的營(yíng)養物質(zhì)；具有菌類(lèi)生長(cháng)環(huán)境條件；經(jīng)過(guò)滅菌，并保持無(wú)菌狀態(tài)。

    2、培養基的選擇：在整菌種制備過(guò)程中，從母種到原種、栽培種，各個(gè)階段的目的要求有所不同，所選用的培養基的配比也應有所區別。一般母種初生菌絲較嫩弱，分解養分能力差，要求營(yíng)養豐富、完全，氮源、維生素的比例應高。須選用易于被菌絲吸收利用的物質(zhì)，如葡萄糖、蔗糖、馬鈴薯、蛋白胨、無(wú)機鹽類(lèi)及生長(cháng)素等為等而原種、栽培種所需數量較多，且菌絲分解能力強，可利用大量農作物秸稈、糞草、棉籽殼、麩皮、米糠等原料作為培養基。

    （二）培養基的種類(lèi)

    1、根據營(yíng)養物質(zhì)的來(lái)源，可以把培養基分炎天然培養基、半合成培養基和合成培養基。

    （1）天然培養基　天然培養基是指用化學(xué)成分還不清楚或化學(xué)成分不恒定天然有機物配制而成的培養基，如各種農副產(chǎn)品及其下腳料──小麥、大豆、玉米粉、麩皮、米糠、作物秸稈、木屑、棉籽殼、甘蔗渣等，以及動(dòng)植物組織的浸出液──牛肉膏、肉湯、馬鈴薯汁、麥芽汁、豆芽汁等都可以用來(lái)配制天然培養基，這種培養基來(lái)源廣，成本低，營(yíng)養豐富，適合于在生產(chǎn)上大規模培養菌類(lèi)使用，但這些天然有機物質(zhì)因產(chǎn)地、品種、生長(cháng)期的不同，化學(xué)成分不能宣。每批成分也不穩定，不宜用來(lái)做精細的科學(xué)實(shí)驗。以分離馴化食用菌培養基

    （2）半合成培養基　為了促進(jìn)食用菌菌絲的生長(cháng)發(fā)育，常在天然培養基中添加適量的無(wú)機鹽類(lèi)，或在合成培養基中添加適量的某些天然有機物，就成為半合成培養基。這類(lèi)培養基種類(lèi)繁多，應用廣泛，也是生長(cháng)菌種和實(shí)際栽培最常用的培養基。

    （3）合成培養基　是指采用化學(xué)成分已知的有機物（碳水化合物、含氮化合物、有機酸類(lèi)）或無(wú)機物配制而成的培養基。這類(lèi)培養基組成和含量明確，價(jià)格較貴，一般用于在實(shí)驗室范圍內做有關(guān)營(yíng)養、代謝、菌種鑒定等有關(guān)于食用菌的生理生化研究。

    2、根據培養基制成后的物理狀態(tài)，可將培養基分為液體培養基、半固體培養基和固體培養基。

    （1）液體培養基　根據食用菌所需的營(yíng)養物質(zhì)，掃一定比例配成營(yíng)養液，叫液體培養基。液體培養基可進(jìn)行營(yíng)養源的篩選實(shí)驗，以及生理生化方面如酶活力等研究，應用液體培養基生產(chǎn)的菌種也可在生產(chǎn)中進(jìn)行使用。

    （2）固化培養基　將各種營(yíng)養成份按比例配制成營(yíng)養液后，加入適量固化劑，如瓊脂，即可配成固化培養基。利用這種斜面試管可保藏及擴大菌種，同時(shí)亦可制成各種平皿固化培養基分離菌種。

    （3）固體培養基　利用各種富含纖維素和木質(zhì)素的農林廢棄物如木屑、棉籽殼、秸稈、玉米蕊等作為主要原料，再加入適量的米糠或麩皮和無(wú)機鹽類(lèi)制成固體培養基。該培養基可作為二、三、級菌種生產(chǎn)用的培養基，也可以用它制成發(fā)酵草粉保藏菌種用的培養基。

    （一）制備牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基

    1、配方：牛肉膏3—5g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、瓊脂20—30g、蒸餾水1000mL。PH值7.4—7.6。

    2、步驟：

    （1）稱(chēng)量：根據用量按比例依次稱(chēng)取各種成分，牛肉膏常用玻璃棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱(chēng)量，用熱水融化后到入燒杯，蛋白胨易吸濕，稱(chēng)量時(shí)要迅速。

    （2）溶解：在燒杯中加入少于所需的水量，加熱，逐一加入各成分，使其溶解，瓊脂在溶液煮沸后加入，融化過(guò)程需不斷攪拌。加熱時(shí)應注意火力，勿使培養基燒焦或溢出。溶好后，補足所需水分。

    （3）調pH值：若PH值不適宜，可用1mol/L NaOH或1mol/LHCl把pH值調至所需范圍。

    （4）過(guò)濾：趁熱用濾紙或多層紗布過(guò)濾，以利于某些實(shí)驗結果的觀(guān)察，如無(wú)特殊要求時(shí)可省去此步驟。

    （5）分裝：按照實(shí)驗要求，可將配制的培養基分裝入試管內或三角瓶?jì)�，分裝時(shí)注意，勿使培養基沾染在容器口上，以免沾污棉塞引起污染。

    液體分裝：分裝高度以試管高度的1/4左右為宜，分裝三角瓶的量則根據需要而定，一般以不超過(guò)三角瓶容積的1/2為宜。

    ‚固體分裝：分裝試管時(shí)其裝入量不超過(guò)試管高度的1/5，滅菌后制成斜面，斜面長(cháng)度不超過(guò)管長(cháng)的1/2。分裝三角瓶，以不超過(guò)容積的1/2為宜。

    ƒ半固體分裝：裝入量以試管高度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝。

    （6）加棉塞：分裝完畢后，在試管口或三角瓶口塞上棉花，以阻止外界微生物進(jìn)入培養基而造成污染，并保證有良好的通氣性能。

    （7）包扎：棉塞上包一層牛皮紙，扎緊，即可進(jìn)行滅菌。

    （8）滅菌：將上述培養基以0.1Mpa，121℃，高壓蒸汽滅菌20min。

    （9）擱置斜面：將滅菌的試管培養基管口端擱在玻璃棒或其他合適高度的器具上，擱置的斜面長(cháng)度以不超過(guò)試管總長(cháng)度的一半為宜。

    （10）無(wú)菌檢驗：滅菌后的培養基放入37℃恒溫箱中培養24h，以檢驗滅菌效果，無(wú)污染方可使用。

    （二）制備馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基

    1、配方：馬鈴薯（去皮）200g、蔗糖15—20g、瓊脂20—30g、蒸餾水1000mL。PH自然。

    2、步驟：

    （1）將馬鈴薯洗凈，去皮，切成大小約為1㎝3的小塊，稱(chēng)200g，放入1000mL水中煮沸20—30分鐘，用雙層沙布過(guò)濾，取其液濾。

    （2）定容：加水補足至1000mL。

    （3）加入蔗糖至全部溶化。

    （4）加瓊脂.至全部溶化。

    （5）趁熱分裝試管及三角瓶。

    （6）加棉塞：分裝完畢后，在試管口或三角瓶口塞上棉花，以阻止外界微生物進(jìn)入培養基而造成污染，并保證有良好的通氣性能。

    （7）包扎：棉塞上包一層牛皮紙，扎緊，即可進(jìn)行滅菌。

    （8）滅菌：將上述培養基以0.1Mpa，121℃，高壓蒸汽滅菌20min。

    （9）擱置斜面：將滅菌的試管培養基管口端擱在玻璃棒或其他合適高度的器具上，擱置的斜面長(cháng)度以不超過(guò)試管總長(cháng)度的一半為宜。

    （10）無(wú)菌檢驗：滅菌后的培養基放入28℃恒溫箱中培養24h，以檢驗滅菌效果，無(wú)污染方可使用。

    注：第（8）（9）（10）步需在實(shí)驗二進(jìn)行。

    1、根據實(shí)驗要求，在實(shí)驗時(shí)間內到實(shí)驗室進(jìn)行實(shí)驗時(shí)，一邊測量，一邊記錄實(shí)驗數據。報告要求準確、美觀(guān)。

    2、 在實(shí)驗中，如果發(fā)生實(shí)驗測量數據與事先的計算數值不符，甚至相差過(guò)大，此時(shí)應該找出原因，不能不了了之。同時(shí)要把通過(guò)實(shí)驗所測量的數據與計算值加以比較，如果誤差一般5％以下。

    3、在報告的最后要完成指導書(shū)上要求解答的思考題。

1、寫(xiě)出制備牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基的步驟。

2、說(shuō)明制備培養基應注意哪些問(wèn)題？