微生物無(wú)菌技術(shù)之滅菌方法（1）

采用無(wú)菌技術(shù)所達到的程度，可以是不同的。一般分為滅菌、消毒和防腐3個(gè)不同層次。滅菌指徹底、永久地消滅物體內外一切微生物；消毒指消除物體表面或內部的病原微生物；防腐則是抑制物體內外微生物的生長(cháng)。在微生物學(xué)研究、微生物工業(yè)生產(chǎn)和大型手術(shù)中，為了獲得可靠的結果、保證生產(chǎn)的順利或避免感染，要求將器具進(jìn)行滅菌，甚至連場(chǎng)地和環(huán)境也要進(jìn)行嚴格的滅菌，而對于一般的食品，為了保證其營(yíng)養成分不受或少受破壞，所以通常只須采取消毒和防腐措施。當然，我們通常在得了炎癥時(shí)服用抗生素或磺胺類(lèi)藥物抑制體內的致病菌，也可以認為是無(wú)菌技術(shù)的應用。例如在培養某些需要生長(cháng)較長(cháng)時(shí)間的微生物或組織時(shí)，通常要加入抑制細菌生長(cháng)的抗生素。

　　實(shí)現滅菌的方法很多，基本上可以分為物理學(xué)方法和化學(xué)方法兩大類(lèi)。

　　物理學(xué)方法主要包括加熱、超低溫、過(guò)濾和電離輻射等。

 

加熱可以引起生命物質(zhì)如蛋白質(zhì)、核酸和脂類(lèi)的破壞，從而導致其死亡。目前使用的有兩大類(lèi)，即干熱滅菌和濕熱滅菌。

　　干熱滅菌最常見(jiàn)的例子是用火焰滅菌。這是最徹底的滅菌方法，但是并不是隨時(shí)隨處可以應用的。我們常常用這種方法來(lái)處理病死的家畜家禽。實(shí)驗室或發(fā)酵車(chē)間也經(jīng)常用火焰滅菌。在要求滅菌后的器具干燥的情況下，通常也采用干熱滅菌。例如用電烤箱在160℃左右保持2小時(shí)，可以將玻璃或金屬器皿完全滅菌。

　　濕熱滅菌的方法更多。因為在有水或水蒸汽存在的條件下，細胞內部更易遭受傷害，所以可以在較低的溫度和較短的時(shí)間內達到滅菌的目的。微生物的營(yíng)養細胞比較容易被殺死，而芽孢則較耐熱。下表列出了在濕熱條件下殺滅幾類(lèi)主要微生物所需要的溫度和時(shí)間。

 

微生物	營(yíng)養細胞	孢子或芽孢
酵母菌	50-60℃，5分鐘	70-80℃，5分鐘
霉菌	62℃，30分鐘	80℃，30分鐘
細菌（中溫細菌）	50-70℃，10分鐘	2-800分鐘，100℃；或120℃，05-12分
病毒	60℃，30分鐘

 

 

目前采用的濕熱滅菌方法有：

　　1）常壓法。其中主要有巴斯德消毒法、煮沸消毒法和間歇滅菌法。前兩種條件比較溫和，所以不能消滅全部微生物，因此是消毒。

　　巴斯德消毒法最早是法國偉大的微生物學(xué)家巴斯德用來(lái)處理葡萄酒防止其變酸的辦法，所以一直用巴斯德的名字命名。這種方法目前仍然大量使用在食品行業(yè)，用于牛奶、啤酒、果酒和醬油等的消毒。消毒后可以保持食品的原有風(fēng)味。這種方法具體實(shí)施時(shí)對溫度和作用時(shí)間的控制要看處理對象決定。例如目前對牛奶的消毒就有低溫維持法和高溫瞬時(shí)法兩種，前者是在63℃維持30分鐘，后者則是在72℃處理15秒。

　　煮沸消毒法是在常壓下通過(guò)煮沸來(lái)達到消毒目的。例如在非高原地區將水加熱到100℃來(lái)消毒飲用水。

　　間歇滅菌法又叫分段滅菌法。在沒(méi)有高壓滅菌設備，滅菌對象又比較穩定的情況下，可以達到基本完全滅菌的目的。一般用于液體的滅菌。方法是將要滅菌的液體在90-100℃加熱15分鐘以上，使營(yíng)養細胞死亡，然后將其冷卻到30℃，并保持這個(gè)溫度過(guò)夜，這時(shí)，滅菌樣品中沒(méi)有被殺死的芽孢因為溫度適合而萌發(fā)成營(yíng)養細胞，到第二天再把該液體在90-100℃加熱15分鐘以上。如此重復3次，即可以將液體中的微生物全部殺死，達到滅菌的目的。某些做微生物學(xué)實(shí)驗的培養基，因為某些成分在120℃左右容易破壞，就可以采用間歇滅菌法。

　　2）加壓法。又稱(chēng)加壓蒸汽滅菌法，因為在超過(guò)大氣壓的密閉容器中，水蒸汽的溫度可以大于100℃，更有利于殺死微生物。例如用加壓滅菌鍋（亦可用家用壓力鍋），當鍋內壓力達到每平方厘米1千克時(shí)，水蒸汽的溫度可以達到121℃，一般微生物的營(yíng)養細胞和芽孢在這個(gè)溫度下通常在15-30分鐘內即可徹底被殺死。加壓蒸汽滅菌法是微生物學(xué)研究和微生物應用產(chǎn)業(yè)中采用得最多的滅菌方法，從19世紀沿用至今。隨著(zhù)滅菌器具的不斷改進(jìn)，效率也越來(lái)越高。

 

 

冷凍和加熱的不同之處是這種方法不是簡(jiǎn)單地破壞微生物，而是抑制微生物的生長(cháng)和繁殖。低溫法抑菌在食品工業(yè)中采用最多，因為在低溫下（4℃左右）大多數病原菌都不能生長(cháng)，在微生物學(xué)實(shí)驗和微生物工業(yè)中，這種方法不能起到滅菌的作用。一般在-20℃微生物就不會(huì )生長(cháng)了，因為此時(shí)沒(méi)有液態(tài)的水供微生物活動(dòng)之用，也有些微生物可以被冰殺死，因為冰會(huì )破壞微生物細胞膜

 

有些需要滅菌的材料不能受熱，例如許多維生素溶液。因此，許多液體可以用過(guò)濾法來(lái)滅菌。過(guò)濾法不是將微生物殺死，而是把它們排除出去。目前過(guò)濾除菌采用兩類(lèi)器具，一類(lèi)叫深層濾器，例如用燒結玻璃、不上釉的陶瓷顆�；蚴�棉壓成的濾板等：另一類(lèi)是濾膜。深層濾器已經(jīng)使用了100年以上，現在有逐漸被濾膜取代的趨勢，但因為大量沉淀物容易堵塞濾膜，所以一般先用深層濾器除去大的顆粒。

　　濾膜一般由醋酸纖維素、硝酸纖維素、多聚碳酸酯、聚偏氟乙烯等合成纖維材料制成。濾膜的孔徑一般為0.2微米，它可以濾除絕大多數微生物的營(yíng)養細胞。過(guò)濾法的最大缺點(diǎn)是不能濾除病毒。

　　我們來(lái)看一下濾膜滅菌是如何工作的。如左圖所示，在一個(gè)漏斗形容器上部放置數片濾膜。右圖是整個(gè)過(guò)濾系統。待除菌的液體裝在三角瓶中（1），用蠕動(dòng)泵（2）將液體抽到過(guò)濾器（3）內，濾過(guò)的液體進(jìn)入事先滅菌的瓶子中。

如果是滅菌少量液體，可以采用一種簡(jiǎn)單的的濾器。

　　過(guò)濾法用途廣泛，除在飲料、藥物生產(chǎn)中使用外，空氣也常常用過(guò)濾法除菌。我們通常做微生物學(xué)實(shí)驗時(shí)滅過(guò)菌的容器一般用棉花塞堵在出口處，實(shí)際上就是過(guò)濾除去空氣中的微生物，使進(jìn)入容器的空氣中沒(méi)有微生物污染。微生物學(xué)實(shí)驗室使用的超凈臺也是用過(guò)濾法除菌。

 

輻射滅菌是利用電磁輻射產(chǎn)生的電磁波殺死大多數物質(zhì)上的微生物的一種有效方法。用于滅菌的電磁波有微波、紫外線(xiàn)（UV）、X射線(xiàn)和γ射線(xiàn)等。它們都能通過(guò)特定的方式控制微生物生長(cháng)或殺死微生物。例如微波可以通過(guò)熱產(chǎn)生殺死微生物的作用；紫外線(xiàn)使DNA分子中相鄰的嘧啶形成嘧啶二聚體，抑制DNA復制與轉錄等功能，殺死微生物；X射線(xiàn)和γ射線(xiàn)能使其它物質(zhì)氧化或產(chǎn)生自由基（OH·H）再作用于生物分子，或者直接作用于生物分子，打斷氫鍵、使雙鍵氧化、破壞環(huán)狀結構或使某些分子聚合等方式，破壞和改變生物大分子的結構，從而抑制或殺死微生物。即使可見(jiàn)光在長(cháng)時(shí)間照射后，也能損害微生物或殺死它們，因為所有光合生物含有葉綠素（或細菌葉綠素）、細胞色素、黃素蛋白等光敏感色素，它吸收光能變成激發(fā)態(tài)或被活化，并將吸收的能量轉移到氧，產(chǎn)生氧自由基作用于細胞，導致機體突變或死亡。輻射滅菌的效果受其它因子制約，例如光可使嘧啶二聚體解體，降低紫外線(xiàn)作用效果，氧可提高X射線(xiàn)或γ射線(xiàn)作用效果等。

　　實(shí)行輻射滅菌的裝置包括微波爐、紫外光燈、陰極射線(xiàn)管、X射線(xiàn)發(fā)生器、放射性核素等。商業(yè)上用于大量物品滅菌使用的放射性源是鈷-60和銫-137，它們發(fā)射出γ射線(xiàn)，相對而言比較廉價(jià)。輻射滅菌用途很廣，例如醫療器械和用具（如注射器燈）、食品、實(shí)驗室的許多塑料制品和多種培養基都是用這種方法滅菌。