(三) 操作實(shí)例
1.赤羽病病毒(AKV)的滴定或純化
(1) 于55mm直徑的滅菌塑料培養皿中培養綠猴腎細胞(Vero)，使形成單層。細胞培養時(shí)間約3－4天，接種量約為2 000 000/ml個(gè)細胞。選取單層細胞全部覆蓋，不留有空洞的培養皿用作試驗。
(2) 用細胞培養液對AKV病毒作10倍倍比稀釋至10-7并保存于4℃。
(3) 每個(gè)稀釋度的病毒液接種3個(gè)平皿。
(4) 接種前棄去細胞培養液,用5mlPBS或細胞培養液沖洗單層細胞,然后棄去沖洗液。
(5) 每個(gè)平皿分別加入0.2ml病毒稀釋液，對照組只用細胞培養液代替，置37℃二氧化碳培養箱吸附一小時(shí)，每15分鐘搖動(dòng)一次，以便使病毒均勻分布。
(6) 按第4步驟沖洗未被吸附的病毒。
(7) 取2倍濃縮的細胞培養液加入等量的1.5％瓊脂(預熱)中，每個(gè)平皿加入7ml，置平臺待冷卻凝固后于37℃二氧化碳培養箱培養約2天，平皿需倒置。
(8) 取2倍濃縮的細胞培養液加入等量的2％瓊脂(預熱)中，每個(gè)平皿加入5ml，置平臺待冷卻凝固后于37℃二氧化碳培養箱中培養至次日。
(9) 結果計算 求每組三個(gè)培養皿的蝕斑平均數，組間蝕斑數的差異應符合稀釋度的規律 (即若10-2組平均100個(gè)蝕斑，則10-3組平均應在10個(gè)左右)，否則應考慮重新試驗。以平均蝕斑數乘以病毒稀釋的倍數再乘以5，即為每毫升病毒原液的蝕斑數。
(10) 選取特征性的若干蝕斑，分別以彎頭吸管在瓊脂層下吸取蝕斑以收獲病毒，然后分別接種到預先制備的單層細胞培養瓶中進(jìn)行增殖或傳代。
(11) 本試驗采用BHK21細胞，可應用于牛流行熱病毒(BEFV)。
2.藍舌病病毒(BTV)血清型鑒定試驗(紙片法)
(1) 抗體紙片制備
① 取已知各種血清型毒株以1×107蝕斑形成單位接種綿羊, 接種后3-4周采血分離血清。
② 制備直徑0.5mm的中性濾紙片，121℃15分種滅菌后保存于干燥環(huán)境。
③ 取上述濾紙片浸入不同血清型的免疫血清后真空凍干, 保存于4℃冰箱備用，使用前以滅菌水濕潤。
(2) 病毒接種
① 用直徑6cm的塑料培養皿培養BHK21或Vero細胞使成單層。
② 以103PFU/0.2ml被檢藍舌病病毒接種于細胞上, 吸附1h。
③ 洗去未被吸附的病毒，棄去洗液。
(3) 覆蓋瓊脂
① 取2倍濃縮的細胞培養液加入等量的1.5％瓊脂，每個(gè)平皿加入7ml，置平臺冷卻凝固。
② 在瓊脂面上按梅花形圖案放上不同型的血清濾紙片, 并做好記號。
③ 把平皿放置在37℃二氧化碳培養箱培養2天。
④ 真空吸出平皿中的濾紙片。
⑤ 取2倍濃縮的細胞營(yíng)養液加入等量的2%瓊脂，每個(gè)平皿加入5ml，重新置37℃二氧化碳培養箱培養2-3天, 待明顯蝕斑抑制環(huán)出現。
(4) 結果判定 出現明顯抑制蝕斑形成(即濾紙片位置下仍保持活細胞被染色)的免疫血清即為該被檢病毒的血清型。
注：本試驗方法同時(shí)可應用于鹿流行性出血病病毒(EHDV) 與藍舌病病毒(BTV)的鑒別。
3.新城疫病病毒(NDV)分離
(1) 取疑似患病禽的組織用細胞培養液勻漿,離心沉淀后取上清液。
(2) 用16孔微量培養板制備雞成纖維原代細胞。
(3) 細胞長(cháng)成單層后吸去培養液，向每孔滴加0.1ml被檢病料, 置37℃吸附2小時(shí)后棄殘液。
(4) 制備1％瓊脂的BME，置40－50℃水浴待用。
(5) 吸取上述瓊脂加入培養板各孔，每孔0.5ml，使冷卻凝固成覆蓋層。
(6) 把培養板倒置，在37℃二氧化碳培養箱培養48h。
(7) 制備含0.002％中性紅的1%瓊脂的BME，置40－50℃水浴待用。
(8) 吸取上述瓊脂加入培養板各孔，每孔0.5ml，使冷卻凝固成第二覆蓋層。
(9) 把培養板倒置，在37℃二氧化碳培養箱繼續培養，48小時(shí)內觀(guān)察結果。
(10) 挑出蝕斑下的細胞作病毒的進(jìn)一步增殖和鑒定。
注：本試驗方法在樣品中病毒含量少的情況下比單純用細胞培養分離要敏感。
4.試驗用各種成份的配制
(1) 細胞營(yíng)養液(用于稀釋病毒)
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10倍199保存液 |
4ml |
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犢牛血清 |
0.8ml |
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3%碳酸氫鈉 |
2.4ml |
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雙蒸水 |
32.8ml |
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40ml |
(2) 兩倍濃縮細胞營(yíng)養液(配制首層瓊脂用)
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10倍199保存液 |
20ml |
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犢牛血清 |
4ml |
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3％碳酸氫鈉 |
12ml |
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1％二乙氨基乙基(DEAE) |
10ml(可選擇) |
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雙蒸水 |
54ml |
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100ml |
(置40－45℃水浴備用)
(3) 1.5％瓊脂
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精制瓊脂糖 |
1.5g |
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雙蒸水 |
加至100ml |
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(0.112MPa高壓滅菌15分鐘，置40－45℃水浴備用。) |
(4) 含中性紅兩倍濃縮細胞營(yíng)養液(配制第二層瓊脂用)
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10倍199保存液 |
20ml |
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犢牛血清 |
10ml |
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3％碳酸氫鈉 |
12ml |
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0.5％中性紅 |
6ml |
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雙蒸水 |
52ml |
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100ml |
(置40－45℃水浴備用)
說(shuō)明：在第二層瓊脂中，中性紅的最終濃度應為1:5000－1:10000。
(5) 2％瓊脂
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精制瓊脂糖 |
2g |
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雙蒸水 |
加至100ml |
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(0.112MPa高壓滅菌15分鐘，置40－45℃水浴備用。) |
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