病毒蝕斑技術(shù)（1）

 

1952年，Dulbecco把噬菌體空斑技術(shù)應用于動(dòng)物病毒學(xué)，從而使病毒蝕斑技術(shù) (Virus plaque formation)成為許多病毒的滴定和研究方法。

 

(一) 原理　病毒感染細胞后，由于固體介質(zhì)的限制，釋放的病毒只能由最初感染的細胞向周邊擴展。經(jīng)過(guò)幾個(gè)增殖周期，便形成一個(gè)局限性病變細胞區，此即病毒蝕斑。從理論上講，一個(gè)蝕斑是由最初感染細胞的一個(gè)病毒顆粒形成的，因而該項技術(shù)常用于病毒顆粒計數和分離病毒克隆。但在實(shí)際操作中，常出現幾個(gè)病毒顆粒同時(shí)感染一個(gè)細胞的情況，影響滴定的準確性和克隆的純一性，為此，接種的病毒液要充分分散和稀釋。對于細胞結合性病毒，如MDV，需用單層細胞；對細胞釋放性病毒，即可用固相介質(zhì)懸浮的細胞，也可用單層細胞，但后者需用瓊脂等固體介質(zhì)蓋在細胞上，以防釋放的病毒在液體介質(zhì)中流動(dòng)。固體介質(zhì)的濃度由病毒的大小而定，大病毒用濃度較低的介質(zhì)，小病毒用濃度較高的介質(zhì)，以便將蝕斑的生長(cháng)速度控制在適宜的范圍內。小蝕斑需用顯微鏡觀(guān)察，1-10mm的大蝕斑可用肉眼計數。為便于肉眼觀(guān)察，常用中性紅等染料染色。因病變細胞不吸收中性紅，病變細胞區便呈現無(wú)色蝕斑。病毒懸液的滴度以每毫升蝕斑形成單位(PFU/ml)來(lái)表示。例如，3個(gè)細胞瓶的平均蝕斑是58，接種量為0.2ml，病毒的稀釋度為2.5×10³ ，則病毒原液的滴度為：

 

58÷0.2×2.5×10³ ＝7.25×10⁵ (PFU/ml)

 

(二) 技術(shù)應用　蝕斑技術(shù)可以應用于分離病毒的克隆(無(wú)性繁殖純系)、病毒或血清的滴定，也可用蝕斑形態(tài)和大小研究病毒的生物學(xué)特性。

 

1.病毒生物學(xué)純化 (Virus biological purification)　在進(jìn)行血清中和試驗時(shí),常常會(huì )出現標準病毒株的滴度下降，因而影響了試驗的準確性,這種情況多見(jiàn)于蟲(chóng)煤病毒。這可能是由于原始毒種的混雜,或者已有許多變異病毒粒子存在其中,甚至出現數量眾多的缺陷病毒所致。這時(shí), 有必要把手上掌握的標準毒株進(jìn)行純化,應用病毒蝕斑技術(shù),挑選出各個(gè)不同的純化病毒, 亦稱(chēng)“克隆株”�？寺『蟮牟《窘�(jīng)在敏感細胞上增殖,測定其滴度,選用合適的毒株用于血清中和試驗。為了更有效地進(jìn)行純化, 必須在覆蓋營(yíng)養瓊脂之前用營(yíng)養液洗去單層細胞上未被吸附的病毒。同時(shí)要控制好稀釋的濃度,一個(gè)培養瓶中的蝕斑數目最好不超過(guò)10個(gè)，挑取在其附近10mm都是健康細胞的蝕斑。挑取后的病毒應傳兩代或兩代以上。一般認為，中性紅染料會(huì )由于“光敏”作用而抑制病毒蝕斑的形成和破壞宿主細胞。因此，加了中性紅覆蓋層的培養物應在暗處培養。

 

2.蝕斑減少中和試驗(Plaque Reduction Neutralization Test)　蝕斑減少中和試驗是檢測血清中和抗體的一種敏感性較高的方法，試驗以使蝕斑數減少 50％的血清稀釋度作為其中的效價(jià)。 試驗使用定量的病毒(100PFU)與不同稀釋度的等量血清混合后感作, 接種預先準備好的單層細胞,再覆蓋上營(yíng)養瓊脂置37 ℃二氧化碳培養箱培養,數天后分別統計蝕斑數,用Karber法計算該血清的蝕斑中和效價(jià)。其操作原理與傳統的血清中和試驗大致相同。

 

由于本試驗的操作比較繁鎖，目前在國內極少應用,國際上也沒(méi)有把它作為一種各國都接受的診斷方法，僅在OIE國際動(dòng)物衛生法典(第六版)中列為對裂谷熱的規定診斷方法之一。