支原體的培養技巧

 

支原體（霉形體）的培養技巧支原體是介于病毒與細菌之間的一類(lèi)微生物，在自然界廣泛存在，使人和多種動(dòng)物、植物害病。

 

它缺乏細胞壁而不同于細菌，能在無(wú)細胞培養基生長(cháng)繁殖，并含有RNA和DNA而有別于病毒。支原體以二分裂方式繁殖，基本形態(tài)為圓形、絲狀形，后者易形成分枝狀菌絲，因而得名支原體。其大小介于病毒和細菌之間，最小直徑125-250nm，可通過(guò)濾器�；�因組小只5×10⁸道爾頓，是已知能自行復制繁殖的原核生物中最小的，因而生物合成能力低，體外培養時(shí)需要富含營(yíng)養，如血清、酵母浸液、核酸等復雜成分的培養基才能生長(cháng)。它生長(cháng)緩慢，倍增時(shí)間1-6小時(shí)，最長(cháng)需三周才形成菌落。菌落中心長(cháng)入瓊脂內部形成中央較密的核，從上方觀(guān)察可見(jiàn)“煎蛋樣”的特殊菌落，因為菌落很小需在低倍鏡下才能看見(jiàn)。Mp從發(fā)酵葡萄糖取得生長(cháng)所需能量。Uu則是通過(guò)水解尿素獲得能量。支原體對抑制細胞壁合成的青霉類(lèi)抗生素不敏感，對抑制蛋白質(zhì)合成的抗生素如四環(huán)素和大環(huán)內酯類(lèi)抗生素的紅霉素等敏感。 

 

一般培養比較多的是肺炎支原體（MP），解脲脲原體(UU）是耐酸不耐堿的，UU培養的原理是在于其菌體中含有脲酶，而UU培養基中含有尿素，UU的生長(cháng)需要其本身的脲酶分解尿素益提供其自身生長(cháng)所需要的營(yíng)養物質(zhì)，UU培養基中含有指示劑酚紅，由于尿素被分解釋放出氨從而使培養基變堿而使培養基由黃變紅，但是這種紅是一種清亮的紅色，透明澄清無(wú)渾濁，UU其適宜的PH值為6.2-6.5，由于尿素分解產(chǎn)氨是PH上升，UU在PH值大于7的條件下會(huì )迅速死亡，因此，在培養時(shí)要隨時(shí)觀(guān)察其液體培養基的PH值，一旦看到培養基變紅，要立即取出，以防培養基PH上升導致UU死亡，一般UU需要在培養至對數生長(cháng)期時(shí)是活力最強的時(shí)候（培養基呈橙紅色變化）。一般UU生長(cháng)需要24小時(shí)。

 

UU的計數也和普通細菌不同，采用顏色單位改變法（CCU法），因為UU的生長(cháng)是澄清清亮透明的，因此無(wú)法用一般的比濁法來(lái)計數！

 

UU的保存：在UU生長(cháng)到對數生長(cháng)期時(shí)，采用甘油保存法，甘油和菌液的比例為3：7，（甘油高壓滅菌），采用程序降溫法，獻4度1小時(shí)，在－20度2小時(shí)，最后放到－80度，但是在－80度最長(cháng)不要超過(guò)半年，因此需要每隔2－3個(gè)月將菌株復蘇一次到對數生長(cháng)期后再保存！

 

另外，UU生長(cháng)所需要的培養基的成分一般每隔單位有所不同，但是有一點(diǎn)肯定，就是需要小牛血清。

 

器具泡酸的目的是為了去除雜質(zhì)，一般在做細胞培養是需要泡酸，做細菌方面的工作要求不需要如此嚴格的，只需要洗干凈，高壓消毒就可以了，在配培養基時(shí)用的是三蒸水，把培養基配好后，最后再加入血清，然后調到所需的PH值，不可以高壓，只能用0.22um的濾膜過(guò)濾除菌！培養基配好后，4度放半年沒(méi)問(wèn)題！

 

沒(méi)有從動(dòng)物身上分離UU，但是剛一開(kāi)始做時(shí)，是從病人的臨床分泌物中分離，臨床分離株需要純化，因為臨床株常常含有很多雜質(zhì)，這些雜質(zhì)會(huì )影響UU的生長(cháng)，導致UU的CCU常常達不到10的3次方，因此對臨床株需要純化，可以在固體平板上見(jiàn)到油煎蛋樣菌落，用滅菌小刀切取菌落瓊脂塊，移入液體培養基中壓碎進(jìn)行培養，等到培養基變黃后，用液體培養基稀釋培養物到10的-4或-5次方，再取0.2-0.4ml于固體平板上，這樣反復2-3次，就可以得到支原體的純種。 

 

CCU一方面和細菌本身濃度有關(guān)，另一方面，確實(shí)與培養基成分有很大關(guān)系，如果培養基營(yíng)養成分差，很難作出來(lái)，如果培養基中只含有鹽成分的話(huà)，高壓是沒(méi)問(wèn)題的，如LB培養基，但是如果里面含有小牛血清或糖類(lèi)等物質(zhì)的話(huà)，絕對不可以高壓，因為這樣會(huì )破壞營(yíng)養成分，只可以過(guò)濾除菌！ 

解脲脲原體培養基配制：（在自制培養基基礎上加：）PH：6。13

　　小牛血清：30ml/250ml

　　10％尿素：12 ml/250ml

　　0．2％酚紅：4。5 ml/250ml

　　青霉素G：50萬(wàn)U/250ml

　　酵母：6。25 g/250ml  

　　磷酸二氫鉀：0。375 g/250ml  

　　天門(mén)冬素：0。025 g/250ml  

自制培養基包括：新鮮牛肉浸液：90毫升

　　蛋白胨：1克

　　氯化鈉：0。5克

　　磷酸二氫鉀：0。15克

　�。ù俗灾婆囵B基可以高壓滅菌）。

加瓊脂配成固體，一般1％即可！ 

 

 

 

支原體是能夠在無(wú)生命培養基上生長(cháng)的最小微生物，其生長(cháng)特點(diǎn)是在液基中是清亮的，因此他的計數無(wú)法通過(guò)比濁法，其對數生長(cháng)期在液體中的表現是表現為橙紅色，這是支原體的代謝活力旺盛，如果顏色呈現桃紅色或深紅色，這時(shí)UU的活力就會(huì )下降，因為UU的最合適PH為6.0-6.5,這時(shí)培養基的PH偏堿，UU可能已死亡。為了區分顏色，可以用一管液體培養基作為顏色改變對照，黃色和橙紅色還是比較好區分的！ 

 

Uu的最適生長(cháng)PH在6.0－6.1之間，這可能與培養基的配制有關(guān)。關(guān)于Uu的計數，CCu是最好的方法：200ul菌液加入第一瓶1.8ml液態(tài)培養基中混勻，然后從中取出200ul加入第二瓶1.8ml液體培養基中，混勻，以此類(lèi)推，10倍稀釋11瓶，做3組平行試驗，求平均值即可。注意，每步操作都要換槍頭。

 

對于Uu的保存，其實(shí)方法也很簡(jiǎn)單：

　　1、用液體培養基培養15－17h（溶液有桔黃色變?yōu)槌燃t色，而且基本在對數生長(cháng)期左右），直接放入0度或－20度，2個(gè)月是沒(méi)問(wèn)題的，如果不放心的話(huà)，可隔一個(gè)月檢查一下活性。

　　2、如果條件允許的話(huà)，可將培養至對數生長(cháng)期的陽(yáng)性液先預凍，然后抽真空即可。保存幾年是沒(méi)問(wèn)題的。復蘇的時(shí)候，直接向其中加入Uu培養基培養即可。