海水中噬菌體的分離

 

1 樣品采集 

 

將一定的樣品放入滅菌三角瓶中，加入對數生長(cháng)期的敏感指示菌如大腸桿菌菌液3～5mL，再加20mL二倍肉湯蛋白胨培養液。

 

2 增殖培養 

 

30℃振蕩培養12～18h, 使噬菌體增殖。

 

3 離心分離 

 

將上述培養液以3000rpm離心15～20min，取上清液，用pH7.0，1%蛋白胨水稀釋至10-2～10-3，用于噬菌體檢查及效價(jià)測定。

 

4 生物測定法

 

4.1雙層瓊脂平板法 

 

4.1.1 倒下層瓊脂 

融化下層培養基，倒平板（約10mL/皿）待用。

 

4.1.2倒上層瓊脂 

 

融化上層培養基，待融化的上層培養基冷卻至50℃左右時(shí)，每管中加入敏感指示菌 (大腸桿菌) 菌液0.2mL，待檢樣品液或上述噬菌體增殖液0.2～0.5mL，混合后立即倒入上層平板鋪平。

 

4.1.3恒溫培養 

 

30℃恒溫培養6～12h觀(guān)察結果。

 

4.1.4 觀(guān)察結果 

 

如有噬菌體，則在雙層培養基的上層出現透亮無(wú)菌圓形空斑──噬菌斑。

 

4.2 單層瓊脂平板法 

 

省略下層培養基，將上層培養基的瓊脂量增加至2%，融化后冷卻至45℃左右，如同上法加入指示菌和檢樣，混合后迅速倒平板。30℃恒溫培養6～16h后觀(guān)察結果。

 

4.3離心分離加熱法（快速檢查） 

 

取大腸桿菌正常培養液和侵染有噬菌體的異常大腸桿菌培養液，4000rpm離心20min，分別取兩組發(fā)酵液的上清液(A1)，一部分于721分光光度計上測定OD650光密度值，另外各取5mL上清液于試管中，置水浴中煮沸2min（A2），檢測A2溶液OD650光密度值，記錄結果。