慢病毒（Lentivirus）

 

慢病毒（Lentivirus）載體是以HIV-1（人類(lèi)免疫缺陷I型病毒）為基礎發(fā)展起來(lái)的基因治療載體。區別一般的逆轉錄病毒載體，它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力。慢病毒載體的研究發(fā)展得很快，研究的也非常深入。該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達。在感染能力方面可有效地感染神經(jīng)元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內皮細胞、干細胞等多種類(lèi)型的細胞，從而達到良好的的基因治療效果，在美國已經(jīng)開(kāi)展了臨床研究，效果非常理想，因此具有廣闊的應用前景。

 

    目前慢病毒也被廣泛地應用于表達RNAi的研究中。由于有些類(lèi)型細胞脂質(zhì)體轉染效果差，轉移到細胞內的siRNA半衰期短，體外合成siRNA對基因表達的抑制作用通常是短暫的，因而使其應用受到較大的限制。采用事先在體外構建能夠表達siRNA的載體, 然后轉移到細胞內轉錄siRNA的策略，不但使脂質(zhì)體有效轉染的細胞種類(lèi)增加，而且對基因表達抑制效果也不遜色于體外合成siRNA，在長(cháng)期穩定表達載體的細胞中，甚至可以發(fā)揮長(cháng)期阻斷基因表達的作用。在所構建的siRNA表達載體中，是由RNA聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子來(lái)指導RNA合成的，這是因為RNA聚合酶Ⅲ 有明確的起始和終止序列，而且合成的RNA不會(huì )帶poly A尾。當RNA聚合酶Ⅲ遇到連續4個(gè)或5個(gè)T時(shí)，它指導的轉錄就會(huì )停止，在轉錄產(chǎn)物3’端形成1~4個(gè)U。U6和H1 RNA啟動(dòng)子是兩種RNA聚合酶Ⅲ依賴(lài)的啟動(dòng)子，其特點(diǎn)是啟動(dòng)子自身元素均位于轉錄區的上游，適合于表達～21ntRNA和～50ntRNA莖環(huán)結構（stem loop）。在siRNA表達載體中，構成siRNA的正義與反義鏈，可由各自的啟動(dòng)子分別轉錄,然后兩條鏈互補結合形成siRNA；也可由載體直接表達小發(fā)卡狀RNA(small hairpin RNA, shRNA), 載體包含位于RNA聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子和4～5Ｔ轉錄終止位點(diǎn)之間的莖環(huán)結構序列，轉錄后即可折疊成具有1~4 個(gè)U  3 ’ 突出端的莖環(huán)結構，在細胞內進(jìn)一步加工成siRNA。構建載體前通常要通過(guò)合成siRNA的方法，尋找高效的siRNA，然后從中挑選符合載體要求的序列，將其引入siRNA表達載體。

 

    慢病毒載體（Lentiviral vector）較逆轉錄病毒載體有更廣的宿主范圍，慢病毒能夠有效感染非周期性和有絲分裂后的細胞。慢病毒載體能夠產(chǎn)生表達shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性細胞、干細胞、受精卵以及分化的后代細胞中表達shRNA，實(shí)現在多種類(lèi)型的細胞和轉基因小鼠中特異而穩定的基因表達的功能性沉默，為在原代的人和動(dòng)物細胞組織中快速而高效地研究基因功能，以及產(chǎn)生特定基因表達降低的動(dòng)物提供了可能性。慢病毒作為siRNA的攜帶者，不但具備特異性地使基因表達沉默的能力，而且充分發(fā)揮了慢病毒載體自身所具備的優(yōu)勢，為基因功能的研究提供了更強有力的工具。

 

慢病毒表達載體包含了包裝、轉染、穩定整合所需要的遺傳信息。慢病毒包裝質(zhì)�？商峁┧�有的轉錄并包裝RNA 到重組的假病毒載體所需要的所有輔助蛋白。為產(chǎn)生高滴度的病毒顆粒，需要利用表達載體和包裝質(zhì)粒同時(shí)共轉染細胞，在細胞中進(jìn)行病毒的包裝，包裝好的假病毒顆粒分泌到細胞外的培養基中，離心取得上清液后，可以直接用于宿主細胞的感染，目的基因進(jìn)入到宿主細胞之后，經(jīng)過(guò)反轉錄，整合到基因組，從而高水平的表達效應分子。