植物內生微生物群落的研究和應用價(jià)值

   在以前極少聽(tīng)到過(guò)：某一微生物（或群落）具有降解和代謝F*B菌代謝排出的有毒、有害的化合物的能力。也極少聽(tīng)到過(guò)：以某種方式，在一定條件下，通過(guò)群落自身調控能力，對其自身種群進(jìn)行改良，使種群獲得新的功能、或新的性能、或新的酶系等。還極少聽(tīng)到過(guò)：某一植物內生微生物群落能很自然的、順理成章的把進(jìn)化的含義添加進(jìn)入微生物發(fā)酵機理（原理）中，使有些發(fā)酵過(guò)程成為菌種改良的過(guò)程，進(jìn)化的過(guò)程，給予微生物發(fā)酵機理（原理）新的內涵。

 

    當發(fā)現植物內生微生物群落（以下簡(jiǎn)單稱(chēng)為群落）時(shí)，從生態(tài)學(xué)可知，群落的種群之間存在著(zhù)協(xié)同進(jìn)化之關(guān)系。而且群落種群的生態(tài)位達到界域時(shí)，即群落由一種原生動(dòng)物、一種細菌、一種真菌、一種古生菌組成。這樣的群落適應新環(huán)境的能力會(huì )更廣、更大、更強。

 

    首先介紹這一植物內生微生物群落的一個(gè)特性。由于群落的進(jìn)化歷程使它具有以下特性，那就是把群落與外植體（植物）組織細胞投放進(jìn)一個(gè)裝有水溶液的容器內，水浸過(guò)外植體，密封容器，使容器內趨向于缺氧狀態(tài)，這時(shí)群落種群會(huì )很快侵入到組織細胞內。在短期內群落與組織細胞相互作用，使群落與組織細胞處于相對平衡狀態(tài)，即趨向于共棲或共生關(guān)系。而不是對寄主細胞采取掠奪方式，將吸取寄主細胞內的大部分蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物而使寄主細胞很快死亡。同樣將上述外植體和水換作牛乳汁，群落種群也會(huì )很快侵入乳脂肪球和酪蛋白膠束內。

   

實(shí)驗之一：

1）把新鮮橙子（果實(shí)）洗凈且切成數片與群落菌種一起投放進(jìn)裝有水溶液的實(shí)驗發(fā)酵容器中，水浸過(guò)橙子（但橙子量過(guò)多），密封容器，進(jìn)行缺氧發(fā)酵。

2）由于發(fā)酵時(shí)，部分發(fā)酵液噴溢出來(lái)，使上面部分橙子露出水面，20d發(fā)酵結束后，容器內空氣中殘留的好氧F*B菌很快侵入露出水面的橙子，隨著(zhù)F*B菌的生長(cháng)及代謝排出許多有毒、有害的代謝產(chǎn)物。不久露出水面的橙子中的營(yíng)養被消耗殆盡，又由于缺氧以及F*B菌代謝出的有毒、有害代謝產(chǎn)物的抑制，使F*B菌進(jìn)入了衰亡期。

3）由于F*B菌生長(cháng)代謝所分泌的有毒、有害的代謝產(chǎn)物將嚴重影響水溶液中的群落生境，為了生存，維持原來(lái)的生境，這時(shí)群落中的真菌就從F*B層中生長(cháng)出來(lái)，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后，F*B層中的物質(zhì)幾乎都被分解、降解、轉化成為有用物質(zhì)，被真菌代謝利用，從而形成一層菌苔。終于完成保護群落的生境的任務(wù)。

4）發(fā)酵液仍然保持清澈透明，打開(kāi)容器，發(fā)酵液仍然揮發(fā)出天然橙子的香氣，沒(méi)有F*B氣味和異味。

5）分析：原來(lái)群落中真菌不可能具有如此豐富、復雜的酶系，能將如此復雜的F*B的有害、有毒化合物降解，并被真菌代謝所利用，這里需要進(jìn)行一系列非常復雜的生物化學(xué)反應，難度之大可想而知。因此這其中過(guò)程，極可能是：真菌從F*B層中生長(cháng)出來(lái)，并對F*B層的基因信息和信息分子等進(jìn)行識別、收集、整理，而群落中的其他種群也分工協(xié)作，有的對信息分子進(jìn)行響應；有的對基因信息進(jìn)行基因修飾、基因變異，產(chǎn)生遺傳變異體，即相應的酶系；有的對基因信息進(jìn)行表達、構建，有的負責對構建的遺傳基因進(jìn)行傳遞等，真菌在群落這種支撐下，完成了對F*B層中有毒、有害化合物的降解和代謝，保護了群落原來(lái)的生境。并且使真菌自身得到了改良，獲得了新本領(lǐng)。

實(shí)驗之二：

  所作實(shí)驗分為三組，一組是對照組，不投放任何菌種；二組是只投放群落中的真菌菌種組；三組是經(jīng)二次投放菌種，才能完成投放完整的群落菌種。培養物是新鮮牛乳汁。

  實(shí)驗目的：觀(guān)察群落能否在新環(huán)境（即經(jīng)初次殺菌的新鮮牛乳汁）中生長(cháng)、代謝，并成為乳液中的主要微生物菌群，且維持乳液（生境）不被破壞（即在室溫下，維持牛乳汁20~30d不變質(zhì)）還能增加牛乳的風(fēng)味物質(zhì)。

  實(shí)驗所用乳液要同一批次，操作和接種環(huán)境要相同。

 

實(shí)驗步驟：

1）新鮮牛乳經(jīng)攝氏59~68度，15s的初次殺菌。

2）分裝到已滅菌的實(shí)驗瓶中，分裝量為容器的容積的1/2，每組3瓶，分為三組。

第一組為對照組，不接種但空的接種操作仍然進(jìn)行；

第二組僅接種一次，菌種為群落中的真菌；

第三組第一次接種與第二組相同，48h后進(jìn)行第二次接種，接種完整群落的菌株；

都蓋上瓶蓋，用保鮮膜（多層）包扎好瓶口。

3）觀(guān)察實(shí)驗過(guò)程

大腸桿菌可溶性蛋白表達及抽提（用于由IPTG誘導的表達體系）：

可溶性蛋白的表達沒(méi)有固定的方法，對不同的蛋白會(huì )有不同的方法，如果抽出的可溶性蛋白不多，可用基本培養基代替LB，用30或25度培養代替37度，IPTG（誘導物）的量也可減少，誘導時(shí)間也可變化。下面的方法僅供參考:

1． 將菌接種于5ml LB（含抗生素）培養基中過(guò)夜培養，

2． 將過(guò)夜培養物全部接種到200ml含抗生素的 MM培養基中，37度培養4-5小時(shí)，加IPTG至終濃度0.5mM（可變），37度培養13小時(shí)。

3． 將細胞培養物用20mM的冰冷的Tris-HCl（pH=7.5）濃縮10倍，

4． 在冰上用超聲波處理（power lever為4-5，duty設為40－50％，60-120次脈沖，每30次脈沖后在冰中放30秒冷卻），

5． 4度10000rpm離心10分鐘,

6． 將上清通過(guò)0.45um的濾膜（細菌過(guò)濾器）

附：MM培養基（1L）

硫酸銨1g，磷酸氫二鉀0.5g，7水硫酸鎂0.2g，7水硫酸亞鐵0.1g。