酵母RNA的分離

1）總酵母RNA的分離

1．在每毫升培養物中加入50μg環(huán)乙酰亞胺，在30℃下振蕩15分鐘。此步亦可省略，但是有人認為環(huán)乙酰亞胺可防止mRNA凝集在多核糖體上。

2．迅速冷凍收集細胞，在大離心管中加入約一半體積的碎冰，將培養物倒入，振蕩，在4℃下以5000r/min離心5分鐘。

3．加入11g玻珠于30ml離心管中，以Corex玻璃離心管為最佳，不過(guò)塑料離心管也能使用。

4．加入3ml已用LETS緩沖液平衡的苯酚到玻珠中。

LETS緩沖液：

0.1 mol/L 氯化鋰

0.01  mol/L Na2EDTA

0.01  mol/L Tris-HCl (pH7.4)

0.2% SDS

0.1% 二乙基焦碳酸（可任選）

5．用2.5ml冰預冷的LETS緩沖液懸浮細胞，并將其加入到上述玻珠苯酚管中。為了使細胞破碎的最好，液面應剛好高于玻珠表面。

6．高速振蕩30秒后，在冰上置30秒，交替進(jìn)行3分鐘，用相差顯微鏡檢測細胞破碎情況，破碎的細胞呈現無(wú)折射的空細胞。

7．當至少90%細胞破碎后，用5ml冰預冷的LETS緩沖液，輕微振蕩，用Sorvall SS－34轉頭以8000r/min離心5分鐘，使溶液分相。離心后，酚層和蛋白質(zhì)界面應剛好低于玻珠表面，移出水相而不會(huì )觸動(dòng)界面。

8．將水相轉到一個(gè)干凈離心管，用5ml苯酚：氯仿：已戊醇（25：24：1）抽提2次，避免觸動(dòng)界面。用氯仿抽提一次。

9．加入1/10

體積的5mol/L氯化鋰，在－20℃下沉淀3小時(shí)。此時(shí)，RNA沉淀可在－20℃下存放。

2）Poly(A)+RNA的分離

1．將保存的RNA用Sorvall SS-34轉頭以10 000r/min離心10分鐘，收集RNA沉淀，用80％乙醇洗滌。真空干燥后，溶于2.5ml蒸餾水中，溶解后加入2.5ml 2×上樣緩沖液，同時(shí)加SDS至終濃度為0.3％。

2．置65℃保溫5分鐘。

3．裝一個(gè)oligo（dT）柱，用1×上樣緩沖液洗3次。

4．用10mmol/L HEPES（pH7）洗脫Poly（A）＋RNA。如果希望得到更滿(mǎn)意的結果，可用加入RNase抑制劑。

5．用蒸餾水對Poly（A）＋RNA進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)�通過(guò)OD260的光吸收測定RNA濃度。用水將10mmol/L HEPES(pH7)稀釋10倍作為對照。

6．加1/10體積3mol/L醋酸鈉和2.5倍體積的無(wú)水乙醇沉淀RNA，上下倒置混勻，在－70℃下放置30分鐘。離心10分鐘，棄上清液，用水溶解RNA沉淀使終濃度為1mg/ml。不管是溶解的RNA或是乙醇沉淀的RNA都能在－70℃下長(cháng)期保存。