土壤微生物分離實(shí)驗

【摘要】利用分離純化微生物的基本操作技術(shù)對土壤中的微生物進(jìn)行分離與純化，根據菌落形態(tài)觀(guān)察、染色鑒定以及一系列的生理生化試驗的結果通過(guò)查閱《伯杰氏系統細菌學(xué)手冊》對照種屬特征最終判斷所分離純化的細菌所屬的屬。

 

【abstract】By several methods and technique, we got the pure cultures of two kinds of bacteria which were separated from soil. According to the results of colony observing, staining, and experiments of physiology and bio-chemistry, we referred to the Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology and finally decided their genus.

 

【關(guān)鍵詞】革蘭氏陽(yáng)性、芽孢、片球菌屬 、 芽孢桿菌屬

實(shí)驗目的：

1、學(xué)習從土壤中分離、純化微生物的原理與方法。

2、學(xué)習、掌握微生物的鑒定方法。

3、對提取的土樣進(jìn)行微生物的分離、純化培養，并進(jìn)行簡(jiǎn)單的形態(tài)鑒定。

4、對簡(jiǎn)單鑒定后的微生物進(jìn)行生理生化鑒定并由鑒定結果查伯杰氏手冊以確定分離出微生物的品種。

 

實(shí)驗原理：

    從復雜的微生物群體中獲得只含有一種或某一株微生物的過(guò)程稱(chēng)為微生物的分離與純化。常用的方法有

1、簡(jiǎn)單單細胞挑取法         

2、平板分離法

此次實(shí)驗采取的是平板分離法，該方法操作簡(jiǎn)單，普遍用于微生物的分離與純化。其原理包括兩方面：

1、在適合于待分離微生物的生長(cháng)條件（如營(yíng)養、酸堿度、溫度與氧等）下培養微生物，或加入某種抑制劑造成只利于待分離微生物的生長(cháng)，而抑制其他微生物生長(cháng)的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物。

2、微生物在固體培養基上生長(cháng)形成的單個(gè)菌落可以是由一個(gè)細胞繁殖而成的集合體。因此可通過(guò)挑取單菌落而獲得純培養。獲得單菌落的方法可通過(guò)稀釋涂布平板或平板劃線(xiàn)等方法完成。

    但是從微生物群體中經(jīng)分離生長(cháng)在平板上的單個(gè)菌落并不一定保證是純培養。因此，純培養的確定除觀(guān)察其菌落的特征外，還要結合顯微鏡檢測個(gè)體形態(tài)特征后才能確定。有的微生物的純培養要經(jīng)過(guò)一系列分離與純化過(guò)程和多種特征鑒定才能得到。

土壤是微生物生活的大本營(yíng)，它所含微生物無(wú)論是數量還是種類(lèi)都是極其豐富的。因此土壤是微生物多樣性的重要場(chǎng)所，是發(fā)掘微生物資源的重要基地，可以從中分離純化的到許多有價(jià)值的菌株。此實(shí)驗將從土壤中分離兩種細菌。

 

實(shí)驗器材、試劑與菌種：

1、器材：

培養皿、載玻片、蓋玻片、普通光學(xué)顯微鏡、量筒、滴管、吸水紙、燒杯、三角瓶、電爐、玻璃棒、接種環(huán)、鑷子、搪瓷杯、恒溫培養箱、高溫滅菌鍋、移液槍?zhuān)�槍頭）、電子天平、濾紙、pH試紙等。

2、 試劑：

配制牛肉膏蛋白胨培養基的原料（牛肉膏、NaCl、瓊脂、蛋白胨）、配置糖發(fā)酵培養基的原料（葡萄糖、K2HPO3、溴百里酚藍、瓊脂、NaCl、蛋白胨）、甘油（丙三醇）、結晶紫染液、番紅染液、碘液、95％乙醇、5％孔雀綠染液、0.5％番紅水染液、3％過(guò)氧化氫水溶液、1％鹽酸二甲基對苯撐二胺溶液、蒸餾水等。

3、 土樣：取自山東大學(xué)7號宿舍樓門(mén)前土壤，地下10cm左右。

 

實(shí)驗步驟：

1、配制牛肉膏蛋白胨培養基：

1）配制牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基500ml （用于12個(gè)平皿和10支試管斜面）

         牛肉膏 0.3% ………………………………… 1.5 g

         蛋白胨 1% ……………………………………  5g

         NaCl  0.5%  ………………………………… 2.5g

         瓊脂   2% …………………………………… 10g

         pH  …………………………………………  7.0~7.2        

2）倒12個(gè)平板和10支試管斜面，包扎，121℃滅菌20min.

2、制備土壤稀釋液：

稱(chēng)取土樣10g，放入盛有100ml無(wú)菌水的帶有玻璃珠的三角瓶中，振蕩搖勻10min 使土和水充分混合，然后用移液槍從三角瓶中吸取1ml（此操作要求無(wú)菌操作），加入另一盛有9ml無(wú)菌水的試管中，混合均勻，以此類(lèi)推分別制成制成0.01、0.001、0.0001不同稀釋度的土壤溶液。

3、涂布培養：

以0.01以及0.0001兩個(gè)濃度的土壤稀釋液作為涂布平板培養的對象，將其分別涂布在3個(gè)牛肉膏蛋白胨培養基中，共6個(gè)培養基，標號，37°C溫箱培養48 h。

4、劃線(xiàn)分離（劃線(xiàn)培養）：

對兩種土壤溶液的微生物培養基進(jìn)行觀(guān)察，記錄兩種區分明顯的細菌性狀。挑取此兩種細菌在新的培養基中劃線(xiàn)培養（每種細菌培養3個(gè)培養皿），標號、37°C培養。

  5、初步鑒定：

對兩種菌進(jìn)行簡(jiǎn)單染色、革蘭氏染色以及芽孢染色觀(guān)察，記錄結果。

6、試管斜面再培養：

      將兩種純菌株接種分別接種在5支試管中，共10支試管。37°C培養（18－24h）。

7、對試管中培養的兩種菌進(jìn)行生理生化鑒定：

   1）過(guò)氧化氫酶鑒定：

     A 實(shí)驗原理：

乳酸菌與許多厭氧菌與其他細菌區分的主要依據是鑒定有無(wú)過(guò)氧化氫酶。該酶可以把過(guò)氧化氫分解為水與氧氣，氣體氧以氣泡跑出來(lái)，則為過(guò)氧化氫酶實(shí)驗陽(yáng)性。乳酸菌和許多厭氧菌在過(guò)氧化氫酶實(shí)驗中呈現陰性。

     B 步驟：

將培養新鮮的待測菌種（培養18－24h內）接在載玻片上，滴一滴3％過(guò)氧化氫于菌體上。

   2）糖發(fā)酵與氧化實(shí)驗

      A 實(shí)驗原理：

在細菌的分類(lèi)鑒定中，糖發(fā)酵與氧化測定是一項重要的依據。絕大多數細菌都可以利用糖類(lèi)作為能源以及碳源，但由于不同的菌存在酶系的差異，因而對糖類(lèi)的發(fā)酵與氧化的能力就有所不同。有的在糖類(lèi)發(fā)酵與氧化代謝中能分解糖類(lèi)，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，有的則只能產(chǎn)酸不可以產(chǎn)氣。酸的產(chǎn)生與否，以及是發(fā)酵型產(chǎn)酸還是氧化型產(chǎn)酸，可以由預先加在培養基中的指示劑（溴百里酚藍水溶液）呈現出來(lái)。這樣把接好菌種的培養基放在厭氧或好氧的環(huán)境下培養，培養基有綠色變?yōu)辄S色為產(chǎn)酸，是否產(chǎn)氣是通過(guò)觀(guān)察培養基中是否產(chǎn)生氣泡或培養基斷裂來(lái)測定。

      B 步驟

       ① 配置糖發(fā)酵培養基150 ml （葡萄糖：、K2HPO3：、溴百里酚藍、瓊脂：、NaCl：、蛋白胨：），分裝試管。

       ② 110°C滅菌培養基20 mins （同時(shí)滅菌一定量甘油，待用）。

       ③ 對兩種細菌進(jìn)行“穿刺”培養，每種菌做5個(gè)試管：2個(gè)蓋管培養，2個(gè)開(kāi)管培養，一個(gè)為蓋管對照組。在培養基的上方加入1－2cm厚的甘油，作為“蓋  管”，以提供菌體無(wú)氧的生長(cháng)環(huán)境，開(kāi)管則不加甘油，作為有氧的生長(cháng)環(huán)境供菌體生長(cháng)。

④ 在37°C下培養，并在培養24h后觀(guān)察培養基中顏色的變化，以及有無(wú)氣泡。

    3）細胞色素氧化酶測定

       A 實(shí)驗原理

    細胞色素氧化酶是氧化酶的一種，它在有分子氧以及細胞色素C存在時(shí)，可以氧化二甲基對苯撐二胺，使之呈現玫瑰紅或暗紅色，在此基礎上還可以與a－苯酚結合生成吲哚酚蘭，出現藍色

       B 步驟

     在干凈培養皿中放一濾紙，用火柴棒取培養18－24h的鑒定菌苔黏在濾紙上，滴一滴1％鹽酸二甲基對苯撐二胺溶液于菌苔上，進(jìn)行觀(guān)察。