電轉化注意事項

一、  制備感受態(tài)的菌液收集時(shí)間：

1、準確測定OD值：OD在1.2～1.5之間。

1） 為了準確測定OD值，建議將菌液稀釋不同濃度測定（1、2、4、8、16倍稀釋?zhuān)�看其OD值是否呈線(xiàn)性關(guān)系）。每個(gè)倍數做3－5個(gè)重復，應該可以大致推斷OD值是否準確！菌液看上去渾濁，但OD值不高，很可能OD稀釋倍數不夠！

2） OD值是否測準也可以這樣估算：OD600為40左右時(shí)，菌體濕重（6000rpm離心5min）約0.95g/10ml。高密度發(fā)酵時(shí)菌體濕重將相應下降。

2、75ml的菌，經(jīng)18h左右的培養，最后sorbital洗滌完畢后，50ml離心管里所剩菌體特別濃，需要1ml sorbitol才可溶解為糊狀。正常培養的OD在1.2～1.5之間的500ml菌液，收集的感受態(tài)也用1ml稀釋的，沒(méi)那么粘稠�？梢钥纯唇档团囵B溫度（27攝氏度）或縮短培養時(shí)間（12h）。

3、甚至不用轉接,直接挑單克隆在50－100mlYPD中搖過(guò)夜，效果也很好

 

二、制備感受態(tài)的菌液量

如果只轉一個(gè)樣品，50ml就夠了，一般50ml的培養液如果OD值正常的話(huà)夠做10管感受態(tài)的，其他的按比例縮小。用大試管搖5ml菌液，然后取1ml毫升在1.5mlEP管中制感受態(tài)，每一步的離心時(shí)間30秒就行。整個(gè)流程時(shí)間短，制備好的感受態(tài)用來(lái)做轉化的效率很高。

山梨醇離心，洗滌的過(guò)程之后的重懸的時(shí)候注意濃度，不要過(guò)于粘稠和稀釋。

 

三、感受態(tài)的保存

感受態(tài)細胞做好后由于電轉化杯還沒(méi)有處理好等原因，在冰上放幾個(gè)小時(shí)再做可能有一定的影響，盡量馬上制備馬上轉化。如果感受態(tài)細胞要保存，不需要加甘油，一般80ul EP管分裝，-70 或 -80 攝氏度保存。

 

另附：酵母GS115點(diǎn)種分離純化

接種GS115于5ml YPD液體培養基，30℃，200rpm振蕩過(guò)夜，涂布 YPD平板，30℃培養48 小時(shí)，用 YNB基本培養基和含His的補充培養基作點(diǎn)種分離純化，挑選在補充培養基生上生長(cháng)而在基本培養基上不生長(cháng)的單菌落劃YPD平板，4℃保存。

 

四、電轉化注意點(diǎn)：

1、感受態(tài)做好后，最后一次吸出sorbital時(shí)，不是直接倒調的，而是用毛細管輕吸出來(lái)的，這樣可能使剩下的感受態(tài)純凈些。

2、最后用毛細管取出100ul出來(lái)，加入質(zhì)粒，混勻�。ㄅ铝坎粔�，吸得很多，電轉時(shí)效果反而不好。）

3、電轉杯清潔處理:一般先沖洗，洗凈；然后浸泡在75%的乙醇中；使用前我們都是放在超凈臺上，開(kāi)啟紫外，邊吹風(fēng)晾干，邊進(jìn)行紫外照射。電轉杯的新包裝或重復使用可能對轉化率有一定的影響。

4、電擊的時(shí)候，電壓數以及電擊時(shí)間可以摸索一下，適當增加電壓或者延長(cháng)電擊時(shí)間都可以。電擊條件比如1.5kv，放電4.8～5.5ms。電擊所有過(guò)程都要盡量在冰上進(jìn)行，電擊時(shí)間可以減少一點(diǎn)，設置為5ms左右，電擊之后馬上加入預冷的山梨醇溶液，轉移至EP管，30度靜止培養1h。如果菌體懸液濃度比較大的時(shí)候，在制備感受態(tài)的時(shí)候要留心一下操作中的問(wèn)題了。

5、電擊之后，加入1ml的山梨醇，吸入1.5ml的ep管中，置于30度搖床低速培養1h，再涂板。

6、注意的是處理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT單獨于-20度保存，可配成100倍的貯備液。

7、轉化后1ml用sorbitol重懸的細胞懸液不能全部涂在一塊板子上，按標準程序制作的感受態(tài)一般3塊左右可能比較合適，以干燥后看見(jiàn)一薄層淡淡的白色為宜。轉化子會(huì )在白色的薄層上長(cháng)出圓韻、飽滿(mǎn)的大菌落的。

 

五、轉化試劑和培養基的正確準備方法

1、MD板子提前幾天做好，放在冰箱里，涂板的時(shí)候吸收效果會(huì )好些。如果是新板子，可能吸收不是太好，板子上有些積層，反而不利于生長(cháng)。

2、YNB42度水浴一會(huì )，然后過(guò)濾除菌，YNB是加到培養基里面的，去離子水pH偏低，建議直接用蒸餾水就可以（關(guān)系不是太大）。

3、山梨醇，以及無(wú)菌去離子水均是冰凍，存放在4度冰箱中

4、一般用10ug以上質(zhì)粒用SalI酶切，然后直接加乙醇沉淀，70％乙醇洗一遍，約20ul ddH2O重溶。轉化效率一般大于100個(gè)克隆每ugDNA。有人用LiCl和DTT處理細胞，轉化效率很高，可以試試。建議你不要用膠回收kit，回收的DNA可能還有鹽，導致電擊時(shí)放電時(shí)間很短。

 

5個(gè)電轉化方案

方法一：高效

1.收集菌體

取1mlGS115過(guò)夜培養物(OD約6-10) 分裝到1.5ml EP管中，4℃、10000g 離心1min，棄上清，沉淀用無(wú)菌水(4℃)洗滌，同樣條件下離心，棄上清。

2.菌體處理

加入1ml處理液，室溫下放置20min。

處理液：

10mM LiAc

10mM DTT

0.6M sorbitol

10mM TrisHCl(pH7.5)

3.離心，棄上清，加入1ml 1M sorbitol ，離心，棄上清，

4.用1M sorbitol洗滌二次，到最終體積約為80μl.（菌體太多可適當棄去部分）

5.加入10μl.經(jīng)過(guò)BglⅡ酶切處理的工程質(zhì)粒，混勻后轉入 電擊杯中，冰浴5min.

6.電轉. 1.5kv，25μF，200Ω條件下進(jìn)行電轉。

7.電擊后立刻加入1mL 1M sorbitol，吸出后于30℃培養2h。

8.取一定量涂平板(YPDS + Zeocin，涂布的量分別為100、200微升，剩余的經(jīng)離心處理后全部涂在一個(gè)平板上)

 

有一點(diǎn)要注意的是處理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT單獨于-20度保存，可配成100倍的貯備液。