⑴ 流感病毒RNA 提�。�
用 Qiagen RNA 提取試劑盒 ，參照使用說(shuō)明步驟如下：
1. 吸取560ul 含有載體RNA ( carrier RNA ) 的 Buffer AVL 到 一個(gè)干凈的1.5ml Eppendorf 管。
2. 吸取140 ul病毒尿囊液/或含有病毒的樣品液到上述的Eppendorf 管里，間斷混勻15 秒，在室溫下靜置10分鐘后快速離心。
3. 在上述的Eppendorf 管里加入560ul 無(wú)水乙醇，間斷混勻15 秒后快速離心。
4. 從上述Eppendorf 管里吸取630 ul 混合液到一個(gè)干凈的QIAamp 離心柱，10000 轉離心一分鐘。
5. 吸取剩余的630 ul 混合液到上述QIAamp 離心柱，10000 轉離心一分鐘。
6. 加750 ul Buffer AW1 至QIAamp 離心柱，10000 轉離心一分鐘。
7. 加750 ul Buffer AW2 至QIAamp 離心柱，10000 轉離心一分鐘。
8. 換一個(gè)干凈的收集管，13000 轉離心一分鐘，把離心柱放入一個(gè)干凈的1.5ml Eppendorf 管。
9. 在離心柱膜中央加入50 ul AVE ,室溫下靜置2-3 分鐘后，10000 轉離心一分鐘。
⑵ cDNA合成：
① RNA 11.5 ul
Uni 12( 2 ug/ul) 0.5 ul
Total 12.0 ul
反應條件： 75.0°C 5min
4°C ∞
② 5 × First Strand Buffer 4.0 ul
DTT ( 0.1M) 2.0 ul
dNTP (10Mm) 1.0 ul
Reverse Transcriptase Ⅲ(200u/ul) 1.0 ul
Total 10.0 ul
反應條件： 55.0 °C 60 min
95.0 °C 5 min
4.0 °C ∞
⑶ PCR 擴增：
10× PCR Buffer 5.0 ul
Mgcl2 ( 25Mm) 3.0 ul
dNTP(10Mm) 1.0 ul
AmpliTaq Gold enzyme 0.5 ul
mQH20 34.5 ul
Forward Primer ( 10um) 2.5 ul
Reverse Primer (10um) 2.5 ul
cDNA 1.0 ul
Total 50.0 ul
反應條件： 1 Cycle 95.0°C 10 min
35 Cycle 94.0 °C 1min
55.0 °C 1min
72.0 °C 1.5min
1 Cycle 72.0 °C 10 min
4.0 °C ∞
(4) 電泳分析.
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