三、制片和染色的基本程序
微生物的染色方法很多，各種方法應用的染料也不盡相同，但是一般染色都要通過(guò)制片及一套染色操作程序。
1、制片
在干凈的載玻片上滴上一滴蒸餾水，用接種環(huán)進(jìn)行無(wú)菌操作，挑取培養物少許，置載玻片的水滴中，與水混合做成懸液并涂成直徑約1厘米的薄層，為避免因菌數過(guò)多聚成集團，不利觀(guān)察個(gè)體形態(tài)，可在載玻片之一側再加一滴水，從已涂布的菌液中再取一環(huán)于此水滴中進(jìn)行稀釋?zhuān)坎汲杀�，若材料為液體培養物或固體培養物中洗下制備的菌液，則直接涂布于載玻片上即可。
2、自然干燥
涂片最好在室溫下使其自然干燥，有時(shí)為了使之干得更快些，可將標本面向上，手持載玻片一端的兩側，小心地在酒精燈上高處微微加熱，使水分蒸發(fā)，但切勿緊靠火焰或加熱時(shí)間過(guò)長(cháng)，以防標本烤枯而變形。
3、固定
標本干燥后即進(jìn)行固定，固定的目的有三個(gè)：
�。保⑺牢⑸�，固定細胞結構。
�。玻┍ＷC菌體能更牢的粘附在載玻片上，防止標本被水沖洗掉。
�。常└淖內玖蠈毎耐ㄍ感�，因為死的原生質(zhì)比活的原生質(zhì)易于染色。
固定常常利用高溫，手執載玻片的一端（涂有標本的遠端），標本向上，在酒精燈火焰外層盡快的來(lái)回通過(guò)3—4次，共約2—3秒鐘，并不時(shí)以載玻片背面加熱觸及皮膚，不覺(jué)過(guò)燙為宜（不超過(guò)60℃）,放置待冷后，進(jìn)行染色。
以上這種固定法在微生物實(shí)驗室中雖然應用較多普遍，但是應當指出，在研究微生物細胞結構時(shí)不適用，應采用化學(xué)固定法�；瘜W(xué)固定法最常用的固定劑有：酒精（95%），酒精和醚各半的混合物，丙酮，1—2%的餓酸等。餓酸能很快固定細胞但不改變其結構，故較常用。應用餓酸固定細胞的技術(shù)如下：在培養皿中放一玻璃，在玻璃上放置玻璃毛細管，在毛細管中注入少量的1—2%餓酸溶液，同時(shí)在玻璃上再放置濕標本涂片的載玻片，然后把培養皿蓋上，經(jīng)過(guò)1—2分鐘后把標本從培養皿中取出，并使之干燥。
4、染色
標本固定后，滴加染色液。染色的時(shí)間各不相同，視標本與染料的性質(zhì)而定，有時(shí)染色時(shí)還要加熱。染料作用標本的時(shí)間平均約1—3分鐘，而所有的染色時(shí)間內，整個(gè)涂片（或有標本的部分）應該浸在染料之中。
若作復合染色，在媒染處理時(shí)，媒染劑與染料形成不溶性化合物，可增加染料和細菌的親和力。一般固定后媒染，但也可以結合固定或染色同時(shí)進(jìn)行。
5、脫色
用醇類(lèi)或酸類(lèi)處理染色的細胞，使之脫色�？蓹z查染料與細胞結合的穩定程度，鑒別不同種類(lèi)的細菌。常用的脫色劑是95%酒精和3%鹽酸溶液。
6、復染
脫色后再用一種染色劑進(jìn)行染色，與不被脫色部位形成鮮明的對照，便于觀(guān)察。革氏染色在酒精脫色后用番紅，石碳酸復紅最后進(jìn)行染色，就是復染。
7、水洗
染色到一定的時(shí)候，用細小的水流從標本的背面把多余的染料沖洗掉，被菌體吸附的染料則保留。
8、干燥
著(zhù)色標本洗凈后，將標本晾干，或用吸水紙把多余的水吸去，然后晾干或微熱烘干，用吸水紙時(shí)，切勿使載玻片翻轉，以免將菌體擦掉。
9、鏡檢
干燥后的標本可用顯微鏡觀(guān)察。
綜上所述，染色的基本程序如下：
制片→固定→媒染→染色→脫色→復染→水洗→干燥→鏡檢。
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