微生物檢驗染色技術(shù)（1）

 

 

由于微生物細胞含有大量水分（一般在80-90%以上），對光線(xiàn)的吸收和反射與水溶液的差別不大，與周?chē)�背景沒(méi)有明顯的明暗差。所以，除了觀(guān)察活體微生物細胞的運動(dòng)性和直接計算菌數外，絕大多數情況下都必須經(jīng)過(guò)染色后，才能在顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察。但是，任何一項技術(shù)都不是完美無(wú)缺的。染色后的微生物標本是死的，在染色過(guò)程中微生物的形態(tài)與結構均會(huì )發(fā)生一些變化，不能完全代表其生活細胞的真實(shí)情況，染色觀(guān)察時(shí)必須注意。

 

　　本節包括四部分：

　　一、染色的基本原理

　　二、染料的種類(lèi)和選擇

　　三、制片和染色的基本程序 

　　四、染色方法 

 

一、染色的基本原理

 

　　微生物染色的基本原理，是借助物理因素和化學(xué)因素的作用而進(jìn)行的。物理因素如細胞及細胞物質(zhì)對染料的毛細現象、滲透、吸附作用等�；瘜W(xué)因素則是根據細胞物質(zhì)和染料的不同性質(zhì)而發(fā)生地各種化學(xué)反應。酸性物質(zhì)對于堿性染料較易吸附，且吸附作用穩固；同樣，堿性物質(zhì)對酸性染料較易于吸附。如酸性物質(zhì)細胞核對于堿性染料就有化學(xué)親和力，易于吸附。但是，要使酸性物質(zhì)染上酸性材料，必須把它們的物理形式加以改變（如改變pH值），才利于吸附作用的發(fā)生。相反，堿性物質(zhì)（如細胞質(zhì)）通常僅能染上酸性染料，若把它們變?yōu)檫m宜的物理形式，也同樣能與堿性染料發(fā)生吸附作用。

　　細菌的等電點(diǎn)較低，pH值大約在2—5之間，故在中性、堿性或弱酸性溶液中，菌體蛋白質(zhì)電離后帶陰電荷；而堿性染料電離時(shí)染料離子帶陽(yáng)電。因此，帶陰電的細菌常和帶陽(yáng)電的堿性染料進(jìn)行結合。所以，在細菌學(xué)上常用堿性染料進(jìn)行染色。

 

　　影響染色的其它因素，還有菌體細胞的構造和其外膜的通透性，如細胞膜的通透性、膜孔的大小和細胞結構完整與否，在染色上都起一定作用。此外，培養基的組成、菌令、染色液中的電介質(zhì)含量和pH、溫度、藥物的作用等，也都能影響細菌的染色。

 

二、染料的種類(lèi)和選擇

 

　　染料分為天然染料和人工染料兩種。天然染料有胭脂蟲(chóng)紅、地衣素、石蕊和蘇木素等，它們多從植物體中提取得到，其成分復雜，有些至今還未搞清楚。目前主要采用人工染料，也稱(chēng)煤焦油染料，多從煤焦油中提取獲得，是苯的衍生物。多數染料為帶色的有機酸或堿類(lèi)，難溶于水，而易溶于有機溶劑中。為使它們易溶于水，通常制成鹽類(lèi)。

 

 

　　染料可按其電離后染料離子所帶電荷的性質(zhì)，分為酸性染料、堿性染料、中性（復合）染料和單純染料四大類(lèi)。

 

1、酸性染料

 

　　這類(lèi)染料電離后染料離子帶負電，如伊紅、剛果紅、藻紅、苯胺黑、苦味酸和酸性復紅等，可與堿性物質(zhì)結合成鹽。當培養基因糖類(lèi)分解產(chǎn)酸使pH值下降時(shí)，細菌所帶的正電荷增加，這時(shí)選擇酸性染料，易被染色。

 

2、堿性染料

 

　　這類(lèi)染料電離后染料離子帶正電，可與酸性物質(zhì)結合成鹽。微生物實(shí)驗室一般常用的堿性染料有美蘭、甲基紫、結晶紫、堿性復紅、中性紅、孔雀綠和蕃紅等，在一般的情況下，細菌易被堿性染料染色。

 

3、中性（復合）染料

 

　　酸性染料與堿性染料的結合物叫做中性（復合）染料，如瑞脫氏（Wright）染料和基姆薩氏（Gimsa）染料等，后者常用于細胞核的染色。

 

4、單純染料

 

　　這類(lèi)染料的化學(xué)親和力低，不能和被染的物質(zhì)生成鹽，其染色能力視其是否溶于被染物而定，因為它們大多數都屬于偶氮化合物，不溶于水，但溶于脂肪溶劑中，如紫丹類(lèi)（Sudanb）的染料。