臨床病原體檢查的常用方法（1）

 

感染（infection）是病原體（pathogen）和人體在一定條件下相互作用的病理過(guò)程，感染的病原體包括各種細菌、病毒、寄生蟲(chóng)、真菌、支原體、衣原體、螺旋體等。病原體的來(lái)源可分為外源性和內源性感染兩種類(lèi)型。外源性感染是由于外界的病原體侵入人體，如志賀菌、結核分枝桿菌、人免疫缺陷病毒（HIV）等引起的感染。內源性感染是人體內經(jīng)常寄生的微生物，如大腸埃希菌、腸球菌、某些真菌等在一定條件下引起的感染。

 

感染后是否引起感染性疾�。╥nfection diseases）與病原體的數量、毒力和人體的抵抗力有關(guān)，并決定感染的發(fā)生、發(fā)展和結局。病原體感染后機體可以出現不感染、隱性感染（covert infection）、顯性感染（overt infection）、持續性感染（persistent infection）或病原體攜帶狀態(tài)（carrier state）幾種類(lèi)型。感染性疾病是由于感染的病原體毒力強、數量多，超過(guò)了機體的抵御能力，定植在機體一定部位增殖、擴散或蔓延、釋放毒素，引起機體免疫病理反應，導致組織、器官等損傷，生理功能紊亂，并出現一系列的臨床癥狀和體征。

 

感染性疾病的檢查主要包括病原體的檢查、感染的血清學(xué)試驗等，并由此確定感染性疾病的發(fā)生和性質(zhì)；通過(guò)病原體的藥物敏感試驗、耐藥株監測和醫院感染的監測報告，為臨床感染性疾病的最佳治療藥物選擇，采取最有效的預防措施，防止感染的傳播或流行提供及時(shí)、有效的實(shí)驗數據。

 

下面介紹臨床病原體檢查的一些常用方法：

 

㈠細菌感染的檢查

 

    1、涂片檢查

 

     臨床標本或分離培養物涂片直接或染色后光學(xué)顯微鏡觀(guān)察，可為進(jìn)一步做生化反應、血清學(xué)鑒定等提供參考依據。通過(guò)顯微鏡觀(guān)察有無(wú)病原體及其大致數量，病原體形態(tài)、染色特征等，可以迅速作出初步診斷，如痰中的抗酸桿菌和腦脊液中的腦膜炎奈瑟菌等。

 

     ⑴不染色標本的檢查     不染色標本一般用于觀(guān)察細菌動(dòng)力及運動(dòng)情況，因為不染色標本直接在普通光學(xué)顯微鏡下，不能清楚看到細菌的形態(tài)與結構特征。細菌未染色時(shí)呈無(wú)色透明，在顯微鏡下主要靠細菌的折光率與周?chē)�環(huán)境不同進(jìn)行觀(guān)察。有鞭毛的細菌在鏡下呈活潑有方向的運動(dòng)，無(wú)鞭毛的細菌則呈不規則布朗運動(dòng)。常用的方法有壓滴法、懸滴法和毛細管法。例如，在高倍暗視野顯微鏡下懸滴米泔樣糞便，觀(guān)察到來(lái)回穿梭似流星樣運動(dòng)的細菌；另制備一標本加入O1群霍亂弧菌診斷血清，若來(lái)回穿梭似流星樣運動(dòng)的細菌停止運動(dòng)，為制動(dòng)試驗陽(yáng)性，可報告疑為O1群霍亂弧菌。

 

     ⑵染色標本的檢查

 

     細菌標本經(jīng)染色后，與周?chē)�環(huán)境在顏色上形成鮮明的對比，可在普通光學(xué)顯微鏡下清楚看到細菌的形態(tài)和某些結構。常用的細菌染色法有：①單染色法只用一種染料將細菌和周?chē)�物體染成同一種顏色，稱(chēng)為單染色法。如呂氏美藍或稀釋石炭酸復紅染色法。細菌經(jīng)單染色法處理后，可觀(guān)察其形態(tài)與排列、大小及簡(jiǎn)單的結構，但不能顯示細菌染色特性。②復染色法用兩種或兩種以上的不同染料進(jìn)行染色，可將不同細菌或同一細菌的不同結構染成不同的顏色。本法既可觀(guān)察細菌的形態(tài)結構，還可根據染色反應及著(zhù)色深淺鑒別細菌的種類(lèi)，故又稱(chēng)鑒別染色法。常用的有革蘭染色法（Gram stain）和抗酸染色法(acid-fast stain)。 通過(guò)革蘭染色，可將細菌分為革蘭陽(yáng)性（G+）和革蘭陰性（G-）兩大類(lèi)，有助于縮小范圍、初步鑒定細菌。例如，在腦脊液涂片中發(fā)現G-的腎形、凹面相對的雙球菌，且在吞噬細胞內或外，則可報告“腦脊液直接涂片找到革蘭陰性雙球菌，形似腦膜炎奈瑟菌”；若發(fā)現有革蘭陽(yáng)性雙球菌，呈矛尖狀、寬端相對尖端向外，且菌體周?chē)�有莢膜，則可報告“腦脊液直接涂片找到革蘭陽(yáng)性雙球菌，形似肺炎鏈球菌”。

 

 

2、分離培養與鑒定     采集臨床標本在選擇性或非選擇性培養基分離培養，觀(guān)察細菌的菌落形態(tài)、生化反應、毒素產(chǎn)生等，并用已知特異性抗體的免疫血清鑒定臨床標本中或分離培養物中未知的細菌，確定致病菌的屬、種和血清型（血清學(xué)鑒定）等。

 

     ⑴分離培養：①增菌培養：由于標本中的細菌較少，用人工的方法提供生長(cháng)繁殖所需的營(yíng)養和最適條件，如溫度、濕度和氣體環(huán)境，使其迅速生長(cháng)繁殖，使菌量增多，供進(jìn)一步作純培養或分離致病菌。大部分細菌在24~48h內培養生長(cháng)良好。②分離培養：對于混有多種細菌的臨床標本或其他培養物，經(jīng)過(guò)劃線(xiàn)接種到合適的選擇性或非選擇性固體培養基表面，因劃線(xiàn)的分散作用，使許多原先混雜的細菌在固體培養基表面分離，一般經(jīng)過(guò)18~24h培養后形成由一個(gè)細菌繁殖而來(lái)的細菌集團—菌落（colony），供細菌計數和純培養用。挑選單個(gè)菌落，轉種至另一培養基中，生長(cháng)出來(lái)的細菌均為純種，稱(chēng)為純培養（pure culture）。分離純培養是從臨床標本中檢查鑒定細菌非常重要的第一步，只有先從含有多種雜菌的標本中分離出目的菌純培養，才能進(jìn)一步對目的菌予以鑒定和研究。

  

  ⑵鑒定：根據純培養細菌的染色形態(tài)、培養生長(cháng)特性、生化反應和血清學(xué)試驗結果，對分離培養的細菌作出鑒定。目前，大多數臨床細菌實(shí)驗室多借助自動(dòng)化細菌鑒定與藥敏試驗系統，可簡(jiǎn)便、快速、準確地鑒定各種分離培養的細菌，并同時(shí)完成抗菌藥物的敏感性試驗。

 

     3、分子生物學(xué)診斷     PCR技術(shù)直接擴增病原體基因的保守序列，配合DNA探針雜交、DNA序列分析、基因芯片（gene chip）技術(shù)等，檢測臨床標本中或分離培養物中細菌的核酸，可以對感染的細菌作出明確的診斷、分類(lèi)、基因分型和直接檢測耐藥基因等，菌落原位雜交也常用于快速篩選陽(yáng)性克隆。特別是分子生物學(xué)檢測技術(shù)操作的自動(dòng)化分析儀，如自動(dòng)化DNA提取儀，定量PCR儀，DNA序列分析儀，脈沖凝膠電泳儀等，使得病原體的分子生物學(xué)診斷有可能在臨床常規應用

 

     ⑴細菌的快速鑒定：幾乎所有致病菌的基因都可直接從標本中進(jìn)行擴增后檢測而不受非致病菌的影響，尤其是對分離培養比較困難的細菌（如結核分枝桿菌）更具特殊意義。目前已用于結核分枝桿菌、沙門(mén)菌、志賀菌、空腸彎曲菌、致病性大腸埃希菌等致病菌的快速鑒定。鑒定各種需氧菌和厭氧菌至種的水平，如鑒別金黃色葡萄球菌、中間葡萄球菌及家畜葡萄球菌，鑒別銅綠假單胞菌、惡臭假單胞菌及熒光假單胞菌，鑒別艱難梭菌、雙酶梭菌及索氏梭菌。

 

     ⑵細菌的分類(lèi)鑒定：通過(guò)對兩菌株DNA雜交百分率判斷其同源性，若＞70%為高度同源性，基因組差別很��；如果兩菌株DNA雜交百分率＜25%為非同源性，兩者不相關(guān)。 

 

     ⑶細菌毒素的檢測：細菌的特異性毒素基因序列決定所產(chǎn)生毒素的種類(lèi)，可用PCR擴增特異的毒素基因片段或直接用其特異性毒素基因探針檢測致病菌的毒素基因，如霍亂腸毒素、金黃色葡萄球菌腸毒素、艱難梭菌毒素等。     ⑷細菌耐藥性檢測：通過(guò)擴增細菌的耐藥基因或直接用耐藥基因的探針檢測標本中或純培養細菌有無(wú)耐藥基因，可以及早了解細菌對某些抗菌藥物的耐藥性或進(jìn)行耐藥性研究，如耐甲氧苯青霉素葡萄球菌的mecA基因、耐β-內酰胺抗生素的TEM型β-內酰胺酶基因。

 

 

     ⑸流行病學(xué)調查：通過(guò)分析流行菌株基因的同源性，可作為流行病學(xué)或醫院感染流行菌株調查的依據。