細菌培養檢測技術(shù)（2）

五、接種操作區
　　為避免在接種過(guò)程中污染環(huán)境以及空氣中的細菌污染培養物，接種均應在接種罩或無(wú)菌室內進(jìn)行，此外細菌學(xué)實(shí)驗室所必需的設備還包括無(wú)菌工作臺、生物安全柜和生物安全實(shí)驗室。
　�。ㄒ唬┙臃N罩　接種罩的式樣很多，可用木框和玻璃制成，亦有用有機玻璃制成。接種罩在用前先以3％石炭酸或來(lái)蘇輕拭，內需裝有紫外線(xiàn)殺菌燈，用前可先行照射，以保證罩內無(wú)塵埃和細菌。操作結束后，應立即清理內部，并作罩內消毒處理。
　�。ǘ�）無(wú)菌工作臺　又稱(chēng)超凈工作臺（super clean bench），目前多采用垂直層流的氣流形式。通過(guò)變速離心風(fēng)機將負壓箱內經(jīng)過(guò)預濾器過(guò)濾的空氣壓入靜壓箱，再經(jīng)高效過(guò)濾器進(jìn)行二級過(guò)濾，從出風(fēng)面吹出的潔凈氣流，以一定的和均勻的斷面風(fēng)速通過(guò)工作區時(shí)，將塵埃顆粒和微生物顆粒帶走，從而形成無(wú)塵無(wú)菌的工作環(huán)境。使用時(shí)應提前50分鐘打開(kāi)紫外線(xiàn)殺菌燈，30分鐘后關(guān)閉并啟動(dòng)送風(fēng)機。凈化區內嚴禁存放不必要的物件，以保持潔凈氣流型不受干擾。
　�。ㄈ�）無(wú)菌室　無(wú)菌室又稱(chēng)潔凈室（clean room），是在實(shí)驗室內部安裝的用于無(wú)菌操作的小室。室內應有空氣過(guò)濾裝置、紫外線(xiàn)殺菌燈等。
　�。ㄋ模┥�物安全柜 （biological safety cabinet，BSC）目前微生物試驗中多采用生物安全柜，是為操作原代培養物、菌（毒）株以及診斷性標本等具有感染性的實(shí)驗材料時(shí)，用來(lái)保護操作者本人、實(shí)驗室環(huán)境以及實(shí)驗材料，使其避免暴露于上述操作過(guò)程中可能產(chǎn)生的感染性氣溶膠和濺出物而設計的負壓過(guò)濾排風(fēng)柜。
　�。ㄎ澹┥�物安全實(shí)驗室（Biosafety Laboratory），簡(jiǎn)稱(chēng)“BSL實(shí)驗室”，是指通過(guò)規范的實(shí)驗設計、實(shí)驗設備的配置、個(gè)人防護裝備的使用等建造的實(shí)驗室。在結構上由一級防護屏障（安全設備）和二級防護屏障（設施）構成，實(shí)驗室生物安全防護的安全設備和設施的不同組合，構成了四級生物安全防護水平，一級為最低。
　　 六、接種法
　　根據待檢標本的性質(zhì)，培養目的及所用培養基的種類(lèi)，采用不同的接種方法。常用的有平板劃線(xiàn)分離培養法、斜面接種法、液體接種法和穿刺接種法。
　�。ㄒ唬┢桨鍎澗�(xiàn)分離培養法
　　分離培養法就是通過(guò)劃線(xiàn)使標本或培養物中混雜的多種細菌在培養基表面逐一分散生長(cháng)，各自形成菌落，以便根據菌落形態(tài)及特征，挑選單個(gè)菌落，經(jīng)過(guò)移種而獲得純種細菌（純培養）。

分離細菌最常用的為平板劃線(xiàn)分離法。
　　1．將接種環(huán)火焰滅菌，待冷卻后取標本或混合菌液。
　　2．用左手持起平板，使平皿蓋向上放于臺面上或打開(kāi)平皿蓋。
　　3．左手斜持（45℃角）平板，右手持已取材的接種環(huán)，在酒精燈上方5～6cm處作連續劃線(xiàn)法分離細菌。劃線(xiàn)時(shí)，接種環(huán)與平板呈30～40°角，輕輕接觸平板，以腕力平行滑動(dòng)接種環(huán)。應避免將瓊脂劃破。先在平板上 l／5處輕輕涂布，然后即可左右來(lái)回以作連續劃線(xiàn)接種，線(xiàn)與線(xiàn)間留有適當距離，做到線(xiàn)密而不重復，將整個(gè)平板表面布滿(mǎn)劃線(xiàn)。
　　如果菌量較大可采用分區劃線(xiàn)法�？蓪⑵矫蠓譃槿舾蓚�(gè)區（一般為5個(gè)區）。先在平板上 l區輕輕涂布，再在2，3……區劃線(xiàn)。每劃完一個(gè)區域，均將接種環(huán)滅菌一次，冷后再化下一個(gè)區域。每一區域的劃線(xiàn)均接觸上一區域的接種線(xiàn) l～2次，使菌量逐漸減少，以獲得單個(gè)菌落。
   4．劃線(xiàn)完畢，蓋好皿蓋，做好標記將平皿倒置，置37℃培養18～24小時(shí)后觀(guān)察結果。
　�。ǘ�）斜面接種法
　　主要用于劃線(xiàn)分離培養所獲得的單個(gè)菌落的移種，以得到純種細菌和保存菌種，以及觀(guān)察細菌的某些培養特性。
　　1．取菌種管置左手食指、中指、無(wú)名指之間，拇指壓住管底部上側面。
　　2．火焰滅菌接種環(huán)。
　　3．以右手小指與手掌拔取棉塞（如同時(shí)持有兩管，可用小指與無(wú)名指拔取另一棉塞），將管口迅速通過(guò)火焰 l～2次。
　　4．將已滅菌的接種環(huán)伸入菌種管中，從斜面上取少許菌，迅速伸入待接種的培養基管中，在斜面底部向上劃一條直線(xiàn)，然后從底部起向上作曲折連續劃線(xiàn)，直至斜面上方頂端。37℃孵箱中培養18～24小時(shí)即可觀(guān)察結果。
　�。ㄈ�）液體接種法
　　肉湯、胨水、發(fā)酵管等均系液體培養基。用于增菌，觀(guān)察細菌生長(cháng)現象和檢測細菌的生化反應等。
　　1．持好菌種管及培養基管。
　　2．滅菌接種環(huán)，由菌種管取菌，伸入培養基管中，在接近液面的管壁上方輕輕研磨，并沾取少許培養基液體調和，使接種物充分混合于培養基的液體中。
　　3．液體培養一般以18～24小時(shí)觀(guān)察生長(cháng)特征為好。
　�。ㄋ模┐┐探臃N法
　　試管內半固體培養基采用此法接種，多用于保存菌種、觀(guān)察動(dòng)力及做厭氧培養等。亦可用于觀(guān)察細菌的某些生化反應。
　　1．持好菌種管和培養基管。
　　2．以滅菌接種針從菌種管取菌。
　　3．接種針直刺入培養基的中心（半固體或一般瓊脂高層）直達管底部（深入培養基3/4處）或沿管壁刺入（醋酸鉛高層），接種后接種針應沿原路退出。
　　4．經(jīng)培養后即可觀(guān)察結果。沿穿刺線(xiàn)生長(cháng)，線(xiàn)外的培養基清亮者表示細菌無(wú)動(dòng)力；穿刺線(xiàn)模糊不清，或沿穿刺線(xiàn)向外擴散生長(cháng)，或整個(gè)培養基混濁者表示細菌有動(dòng)力。
　　 七、培養法
　　根據培養目的和細菌的種類(lèi)選用最適宜的培養方法。常用的有一般培養法、二氧化碳培養法和厭氧培養法。
　�。ㄒ唬┮话闩囵B法
　　一般培養法系指需氧菌或兼性厭氧菌等在需氧條件下的培養方法，故又稱(chēng)需氧培養法。將已接種好的置37℃孵箱中培養18～24小時(shí)。但標本中菌量很少或難于生長(cháng)的細菌（如結核分技桿菌）需培養3～7天甚至 l個(gè)月才能生長(cháng)。
　�。ǘ�）二氧化碳培養法
　　某些細菌的培養，需要5～10%二氧化碳環(huán)境中培養才能生長(cháng)良好�？刹捎枚�氧化碳孵箱，它能自動(dòng)調節二氧化碳的濃度和溫度，使用極為方便。傳統的方法則采用燭缸法，將培養基放入缸內，點(diǎn)燃蠟燭放在缸中，加蓋（涂以凡士林）密閉。因燃燒而產(chǎn)生CO2大約占5～10%，基本可滿(mǎn)足細菌培養的要求。
　�。ㄈ�）厭氧培養法
　　厭氧菌標本的采集及運送有特殊的要求及注意事項，應避免正常菌群的污染，盡量少接觸空氣并立刻送檢。厭氧菌的培養法可大致分為：①物理學(xué)方法：遮斷空氣法（層積法）、真空法、 空氣置換法、厭氧罐培養、厭氧袋法、厭氧手套箱等。②化學(xué)方法：焦性沒(méi)食子酸法、硫乙醇酸鈉法、黃磷燃燒法。③生物學(xué)方法： 需氧菌共生法、燕麥發(fā)芽法。④混合法：真空或氣體置換與焦性沒(méi)食子酸法相結合，可根據實(shí)際情況選用。