霍亂弧菌及其檢驗

 

1．分類(lèi)

 

（1）血清分型 霍亂弧菌（V.cholerae）有不耐熱的H抗原和耐熱的O抗原。前者為共同抗原，特異性低，后者具有群特異性和型特異性，是霍亂弧菌分群和分型的基礎。根據O抗原的不同，霍亂弧菌現有155個(gè)血清群，其中僅O1群和O139群引起霍亂。O139血清群是新出現的型別，與O1群抗血清無(wú)交叉反應，但可與O22和O155血清群產(chǎn)生交叉反應，遺傳學(xué)特征和毒力基因與O1群相似。O2血清群～O138血清群可引起人類(lèi)的胃腸炎，無(wú)明顯的季節分布，不引起霍亂流行，不被O1群霍亂弧菌多價(jià)血清所凝集，稱(chēng)之為非O1群霍亂弧菌，以往也稱(chēng)不凝集弧菌或非霍亂弧菌。

 

O1群霍亂弧菌的O抗原由A、B、C三種抗原成分組成，A是O1群的群特異性抗原，通過(guò)三種抗原成分的不同組合可分成三個(gè)型別:AB構成小川型、AC構成稻葉型、ABC構成彥島型。彥島型的抗原性不穩定，各型之間可以相互轉換，以小川型和稻葉型為常見(jiàn)流行型別。

（2）生物型 根據生物學(xué)特性，O1群霍亂弧菌可分為古典生物型和El-Tor生物型，兩個(gè)生物型具有相同的血清型。El-Tor生物型是具有溶血性的生物型，現發(fā)現El-Tor生物型細菌在環(huán)境中的抵抗力、存活力更強，在我國流行的以El-Tor小川型為主。

 

（3）噬菌體分型 根據霍亂弧菌對噬菌體的裂解模式不同進(jìn)行分型，得到32個(gè)型，其中第Ⅳ組和第Ⅴ組噬菌體較為實(shí)用，前者以裂解古典生物型為主，后者僅對El-Tor生物型有高度特異性。

 

2．細菌特性

（1）形態(tài)染色 革蘭染色陰性，呈弧形或逗點(diǎn)狀，菌體尾端有一鞭毛，運動(dòng)活潑，懸滴鏡檢可見(jiàn)穿梭狀運動(dòng)，患者糞便直接涂片可見(jiàn)弧菌縱列呈“魚(yú)群”樣，O139群弧菌亦為單端單鞭毛，有莢膜。

（2）培養特性 需氧或兼性厭氧菌，在16～44℃均可生長(cháng)，最適生長(cháng)溫度37℃；營(yíng)養要求不高，在普通培養基上生長(cháng)良好，耐堿，在pH6.8~10.2范圍均可生長(cháng)，一般增菌培養常用pH8.4～8.6的1％堿性蛋白胨水進(jìn)行選擇性增菌。常用的選擇性培養基有硫代硫酸鈉-枸櫞酸鹽-膽鹽-蔗糖瓊脂平板（TCBS平板），霍亂弧菌發(fā)酵蔗糖產(chǎn)酸，菌落呈黃色；4號瓊脂和慶大霉素瓊脂平板，因含亞碲酸鉀，霍亂弧菌在其上生長(cháng)將培養基中的碲離子還原成元素碲，形成灰褐色菌落。血平板上菌落較大，El-Tor生物型可形成β溶血環(huán)�？稍跓o(wú)鹽培養基上生長(cháng)，但在含有高于60g/L氯化鈉的培養基上不能生長(cháng)；O139群霍亂弧菌能在無(wú)鹽及30g/L氯化鈉蛋白胨水中生長(cháng)，不能在80g/L濃度下生長(cháng)。

（3）生化反應 氧化酶、明膠液化和吲哚試驗陽(yáng)性，發(fā)酵蔗糖和甘露醇，賴(lài)氨酸、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶陽(yáng)性，精氨酸雙水解酶陰性�；魜y弧菌古典生物型和El-Tor生物型的區別見(jiàn)表12-1。

 

                   表12-1 霍亂弧菌古典生物型和El-Tor生物型的區別

 

 

注：+，≥90％陽(yáng)性；-，≥90％陰性；D，10%～89%陽(yáng)性。

（4）抵抗力 霍亂弧菌對干燥、熱、酸和消毒劑均敏感，但在自然環(huán)境中存活時(shí)間較長(cháng)， O139群霍亂弧菌在水中存活時(shí)間較O1群霍亂弧菌長(cháng)。

3．臨床意義

霍亂弧菌O1群和O139群是烈性腸道傳染病霍亂的病原體。在自然情況下，人類(lèi)是霍亂弧菌的易感者。人通過(guò)攝入霍亂弧菌污染的食物或水，引起霍亂。進(jìn)入腸道的霍亂弧菌通過(guò)鞭毛運動(dòng)穿過(guò)腸黏膜表面的黏液層，接近腸黏膜上皮細胞，通過(guò)普通菌毛的作用定植。腸道內的環(huán)境有利于霍亂弧菌的繁殖，產(chǎn)生霍亂腸毒素，導致疾病的發(fā)生。

霍亂弧菌的主要致病因素是霍亂毒素（cholera toxin，CT），CT是目前已知的致瀉毒素中最強烈的毒素,可造成腸液大量分泌，導致嚴重的嘔吐和腹瀉，使體內水分和電介質(zhì)大量丟失，形成嚴重的水樣腹瀉綜合征。

 

4.微生物學(xué)檢驗

 (1)檢驗程序

(2) 標本采集 霍亂是烈性腸道傳染病，檢驗標本主要以病人的大便為主，必要時(shí)嘔吐物和被嘔吐物污染的衣褲亦可作為標本。一般采取新鮮糞便，或用棉拭子插入直腸內4～5cm采取。病人標本最好床邊接種，預計能在3h內進(jìn)行培養者，可將肛拭子置于滅菌的含堿性蛋白胨水的試管中，或將10～15ml大便放在帶蓋的廣口瓶中，送往實(shí)驗室。不能在3h內進(jìn)行接種或需送至較遠實(shí)驗室的，應將標本轉至卡-布半固體運送培養基中送檢，避免使用甘油鹽水緩沖運送培養基。送檢標本應密封并派專(zhuān)人送達。

（3）檢驗方法

1）顯微鏡檢查 ①涂片染色:取病人“米泔水”樣或黏液絮狀糞便標本直接涂片，革蘭染色或1：10稀釋復紅染色，鏡檢；一般新鮮糞便中弧菌較典型，排列呈“魚(yú)群”狀，菌株隨人工培養傳代次數增加或菌落放置過(guò)久而逐漸變?yōu)椴坏湫偷亩虠U狀；②動(dòng)力觀(guān)察：可用懸滴法、壓滴法或暗視野顯微鏡觀(guān)察動(dòng)力，霍亂弧菌運動(dòng)活躍，新鮮糞便標本中常呈“穿梭樣”或“投標樣”運動(dòng)；③制動(dòng)試驗：將病人“米泔水”樣糞便或6h的增菌液0.25ml同0.25ml適當稀釋的霍亂多價(jià)“O”免疫血清混合，5min后作暗視野或懸滴法檢查，并以生理鹽水與標本混合作為對照，有免疫血清存在時(shí)，菌體凝集成塊，動(dòng)力消失；④直接熒光抗體染色檢查和O1群抗原單克隆抗體凝集試驗，可快速診斷霍亂弧菌感染。

2）分離培養 將標本直接接種于堿性蛋白胨水，或將運送培養基的表層接種于堿性蛋白胨水中35℃6～8h后，轉種至TCBS瓊脂或4號瓊脂或慶大霉素瓊脂平板，35℃培養12～18h觀(guān)察菌落形態(tài)，TCBS上出現黃色菌落，4號瓊脂或慶大霉素平板上出現灰褐色中心的菌落，均為可疑菌落，應使用O1群和O139群霍亂弧菌的多價(jià)和單價(jià)抗血清進(jìn)行玻片凝集試驗，結合菌落特征和菌體形態(tài)，作出初步報告。

將與抗血清凝集的菌落進(jìn)一步純培養，依據全面的生化反應、血清學(xué)分群及分型進(jìn)行最后鑒定。符合霍亂弧菌的菌株尚需區分古典生物型和El-Tor生物型（表12-1）。

3）鑒定 用于霍亂弧菌的鑒定試驗有：①霍亂紅試驗:霍亂弧菌的兩種生物型均呈陽(yáng)性反應，但是，本反應并非霍亂弧菌特有，許多能分解色氨酸和還原硝酸鹽的細菌，均能產(chǎn)生陽(yáng)性反應；②糖發(fā)酵試驗:霍亂弧菌分解葡萄糖、蔗糖、甘露醇產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不發(fā)酵阿拉伯糖；③粘絲試驗:弧菌屬細菌除副溶血弧菌部分菌株外，均有此反應；④O/129敏感試驗：參照藥敏試驗方法進(jìn)行。將O/129 10μg和150μg的紙片貼在接種有待測菌的瓊脂平板上，35℃孵育18～24h后，紙片周?chē)�出現任何大小的抑菌環(huán)均為敏感；O1群和非O1群霍亂弧菌均敏感，但已有對O/129耐藥的菌株出現；O139群對O/129耐藥，用此試驗作鑒定時(shí)需特別謹慎，需結合其他試驗結果加以綜合考慮；⑤耐鹽試驗:霍亂弧菌可在不含氯化鈉和含有6％氯化鈉培養基中生長(cháng)，氯化鈉濃度高于6％則不生長(cháng)。

4）霍亂弧菌的生物分型試驗 見(jiàn)表12－1，這些試驗中，每種試驗都可能或多或少地存在例外情況，可根據實(shí)驗室具體情況采用數種試驗，多數符合，一般情況下即可判定霍亂弧菌的這兩個(gè)生物型。

（4）耐藥性 致病性弧菌在MH培養基上生長(cháng)良好，可用NCCLS規定的紙片擴散法進(jìn)行體外抗生素藥敏試驗，常規測定氨芐西林、四環(huán)素、氯霉素、SMZ-TMP、呋喃唑酮。對于具有自限性的腹瀉而言，體外藥敏試驗并非必需，但對監控弧菌的耐藥性發(fā)展趨勢有意義。

（5）結果與報告 霍亂屬于法定的甲類(lèi)傳染病，一旦從病人糞便標本中分離出霍亂弧菌，需立即向上級管理部門(mén)報告。