耐多藥結核分枝桿菌基因突變在耐藥性檢測中的應用

 

［摘  要］ 目的：探討結核分枝桿菌耐鏈霉素(SM)和利福平(RFP)的耐藥分子機制，應用聚合酶鏈反應一單鏈構象多態(tài)性(PCRSSCP)同時(shí)檢測rpsL基因、rpoB基因突變在結核分枝桿菌耐SM和RFP耐藥性測定中的應用價(jià)值。方法：采用PCRSSCP技術(shù)對168株結核分枝桿菌臨床分離株rpsL基因、rpoB基因突變同時(shí)進(jìn)行檢測。即首先用PCR方法同時(shí)擴增RFP、SM的rpoB基因和rpsL基因，然后進(jìn)行SSCP分析。結果：以結核分枝桿菌H37RV為對照，82株藥物敏感株的rpsL基因、rpoB基因均未見(jiàn)SSCP圖譜異常。特異性為100％。86株同時(shí)耐SM和RFP的耐藥株中，68株(79．1％)有rpsL基因圖譜異常；81株(94．2％)有rpoB基因圖譜異常。結論:rpoB基因突變和rpsL基因突變分別是結核分枝桿菌耐RFP和SM的主要分子機制。應用PCRSSCP技術(shù)可同時(shí)快速檢測結核分枝桿菌SM和RFP耐藥性。 本文來(lái)自檢驗地帶網(wǎng)

 

    ［關(guān)鍵詞］ 結核分枝桿菌；藥物耐受性；鏈霉素；利福平；rpsL基因；rpoB基因

 

 

    Abstract：Objective To study on the molecular mechanisms of rifampin and streptomycinresistant Mycobacterium tuberculosis.Detection rpoB and rpsL gene mutations in rifampin and streptomycinresistant Mycobacterium tuberculosis using Polymorphism(PCRSSCP).Methods 168 clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis of rpoB and rpsL genes were detected using PCRSSCP.Results Strain H37RV was used as control, SSCP pattern of rpoB,rpsL PCR amplification from 82 drug susceptible strains were all the same as control.The specificity was 100%.SSCP pattern of rpsL gene were different from control in 68 drug resistant clinical isolates.SSCP pattern of rpoB gene were different from control in 86 drug resistant clinical isolates.The sensitivity were 79.1%(rpsL),94.2%(rpoB),respectively.Conclusions The results confirm that mutations of rpsL and rpoB genes are the most important mechanisns in streptomycin and rifampin resistant tuberculosis, respectively. www.labdd.com

 

    Key words:Mycobacterium tuberculosis；Drug resistance；Streptomycin；Rifampin； RpsL gene；rpoB gene

 

 

    利福平(RFP)、鏈霉素(SM)是結核病治療中最重要的兩種一線(xiàn)抗結核藥物，其耐藥情況日益嚴重。而傳統的結核分枝桿菌耐藥性測定由于耐藥結核分枝桿菌生長(cháng)極為緩慢，需6周~8周甚至更長(cháng)時(shí)間，不能及時(shí)指導臨床用藥。近年來(lái)在耐藥性快速測定方面取得了一些進(jìn)展［1］。有文獻報道［2］結核分枝桿菌耐SM的產(chǎn)生與其核糖體蛋白S12編碼基因rpsL基因突變有關(guān)。而RFP耐藥則與RNA聚合酶的β亞基的編碼基因rpoB突變有關(guān)。因此，建立一種新的快速、有效的藥敏試驗方法對結核病的早期治療具有重要的意義。我們在用PCRSSCP方法單獨檢測rpsL和rpoB基因突變時(shí)，發(fā)現在非變性聚丙烯酰胺凝膠中，這兩種基因的遷移率不同，且位置不重疊，差異很大。因此，我們在一個(gè)反應中同時(shí)擴增rpsL基因和rpoB基因。在根據其SSCP圖譜進(jìn)行分析，這樣就可以同時(shí)檢測SM和RFP耐藥性，大大節省了時(shí)間和材料�，F將結果報告如下。

 

 

 

    1  材料和方法

    1．1  菌種來(lái)源  結核分枝桿菌H37RV標準株來(lái)源于中國藥品生物制品檢定所。82株藥物敏感株和86株同時(shí)對SM和RFP耐藥株來(lái)自解放軍三零九醫院和本院結核科。按結核病診斷細菌學(xué)規程進(jìn)行菌種鑒定及藥物敏感性試驗，耐藥株同時(shí)對SM和RFP耐藥。受試臨床分離株均鑒定為結核分枝桿菌。

    1.2  細菌DNA提取  結核分枝桿菌H37RV標準株、結核分枝桿菌臨床分離株在LJ雞卵培養基上37 ℃培養4周，分別刮取菌落研磨，以TE液懸浮。破壁采用經(jīng)典的酶解法，用常規酚/氯仿提取。

    1．3  引物  分別由上海塵工和中科院微生物所合成。序列為rpsL15’AGTAAGGTCAAGACCGCGrpsL25’CTGCGTATCCAGCGAACC擴增片段長(cháng)度267bp。rpoB１5’CGGATGACCACCCAGGACrpoB25’GGTTTCGATCGGGCACAT擴增片段長(cháng)度258bp。PCR反應體系：采用25 μl反應體系，4×dNTPS終濃度為0．3 mmol/L，比較了rpsL和rpoB不同引物濃度對PCR擴增的影響。擴增程序為95 ℃預變性10 min，94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)，最后一個(gè)循環(huán)72 ℃保溫7 min，擴增產(chǎn)物經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳，紫外檢測出現267bp和258bp兩條帶。

 

    1．4  SSCP銀染  取擴增產(chǎn)物5 μl~10 μl，加入等量甲酰胺變性液，煮沸變性10 min，立即冰浴5 min后，在8％非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳。條件為6 ℃、100 V電壓，電泳約2 h~3 h，電泳結束后，取凝膠板行硝酸銀染色，觀(guān)察結果并照像。

    2  結果

    2．1  PCR擴增時(shí)引物選擇  實(shí)驗證明rspL基因引物終濃度為0．1 μmol/L，rpoB基因引物終濃度為0．3　μmol/L時(shí)，擴增條帶清晰,產(chǎn)量基本一致，擴增效果好。

 

 

    2．2  SSCP結果  168株結核分枝桿菌臨床分離株中，82株藥物敏感株SSCP同標準株H37RV圖譜相同，無(wú)突變檢出。86株同時(shí)耐SM和RFP分離株中，有68株有rspL基因發(fā)生突變，突變率為79．1％。同時(shí)有81株有rpoB基因發(fā)生突變，突變率為94．2％。結果見(jiàn)表1。

 

 

 

    表1  SM和RFP耐藥與rspL和rpoB基因突變結果常規藥敏試驗   （略）

注：a耐藥株SSCP圖譜與敏感株有差異

 

 

    3  討論

    PCRSSCP是一種快速，準確的耐藥分析方法。以往的報道均為單基因PCRSSCP［4］。近年來(lái)雖然也出現了一些新的結核病耐藥性檢測方法［3］線(xiàn)性探針如DNA序列分析、生物芯片等，但都有各自的局限性�；騼r(jià)格昂貴，或步驟繁瑣，不適于推廣。我們采用雙基因PCR擴增后，再進(jìn)行SSCP分析，結果表明，同時(shí)耐SM和RFP臨床分離株rpsL基因突變率為79．1％，rpoB基因的突變率為94．2％，敏感株均無(wú)突變，特異性為100％，這與國內外報道相似［5，6］。表明rpsL基因突變、rlpoB基因突變是結核分枝桿菌耐SM和RFP耐藥的主要分子機制之一。影響PCRSSCP的因素很多。由于rpoB基因是單挎貝，其PCR擴增的敏感性較低，且為屬特異性，因此，我們在進(jìn)行PCR擴增時(shí)，加大了rpoB擴增的引物量，并同時(shí)相應增加了4×dNTPS的量，選擇了最適的擴增條件。在PCR擴增時(shí)由于兩種引物相互競爭，擴增的條帶可能以一條為主，而另一條淡或不甚清晰，但由于SSCP銀染的敏感性很高，所以并不影響結果的判讀。因此，對于同時(shí)進(jìn)行兩種基因的SSCP檢測時(shí)，PCR擴增條件的選擇顯得非常重要。在進(jìn)行SSCP時(shí)，由于rpoB和rspL基因擴增的產(chǎn)量可能有所不同：因此在顯色時(shí)注意觀(guān)察以H37RV對照的條帶清晰為主，兼顧待測菌株的顯色情況，適時(shí)終止反應。我們采用雙基因擴增PCRSSCP技術(shù)同時(shí)對結核分枝桿菌臨床分離株的SM、RFP耐藥性進(jìn)行檢測使應用傳統藥敏法需時(shí)1個(gè)月~2個(gè)月縮短到2 d即可完成。并同時(shí)使SM和RFP耐藥株得以同時(shí)檢出，大大縮短了檢測時(shí)間，適于臨床的推廣應用。

    參考文獻：

 

    [1] Marttuke G J,Soini H,Vyhneueskiy B,et al.Rapid detection of rifampinresistant.Mycobacterium tuberculosis by sequencing and line probe assay［Ｊ］.Scand J Infect Dis, 1998，30(2):129132.

    [2] Gingeras TR,Ghandour G,Wang E,et al.Simultaneous genotyping and species identufication using hybrdization pattern recopnition analysis of genetic mycobacterium DNA arrays［Ｊ］.Genome Res,1998，8(9)：84358448.

    [3]  張小剛，何秀云，陳紅兵，等.結核分枝桿菌耐藥分子機制的檢測技術(shù)的研究［J］.中國現代醫學(xué)雜志，2003，13(10):2931.

    [4]  Williams D,Wagues Pack C,Eisenack K,et al.Characterization of rifampin in pathogenic Mycobacteria［Ｊ］.Antimicrob Agents Chemother,1994,38:23802386.

    [5]  莊玉輝，何秀云，張小剛，等.利福平結核分枝桿菌耐藥分子機制的研究［J］.中華結核和呼吸雜志，2000，23(10):711714.

    [6]  Wison TM,Collins DM.ahpc,a gene involved in isoniazid resistance of the Mycobacterium Complex［Ｊ］.Mol Microbiol,1996,19:1025.