分解纖維素的微生物的分離試驗

纖維素是地球上含量最豐富的多糖類(lèi)物質(zhì)，它能被土壤中某些微生物分解利用，是因為它們能夠產(chǎn)生纖維素酶。本實(shí)驗通過(guò)從土壤中分離分解纖維素的微生物，初步鑒定了其形態(tài)特征和生理生化特性，為日后更進(jìn)一步的研究打下基礎。

一:實(shí)驗原理

1.纖維素與纖維素酶

纖維素與淀粉都是由葡萄糖組成的，但組成兩者的葡萄糖的連接方式不同，因而使兩者的形態(tài)完全不同。纖維素是由葡萄糖分子按β-1,4糖苷鍵連接而成的，淀粉是由葡萄糖分子按α-1,4糖苷鍵連接而成的。

人類(lèi)以淀粉為主要能量來(lái)源，但完全不能消化纖維素，而反芻動(dòng)物和大量的微生物則主要以纖維素為能量來(lái)源。這是因為，在反芻動(dòng)物的瘤胃中生活著(zhù)大量的可以分解纖維素的微生物。微生物產(chǎn)生的纖維素酶是一種復合酶，包括內切酶（Cx酶）、外切酶（C1酶）和葡萄糖苷酶。內切酶作用于無(wú)定型的纖維素區域，使纖維素斷裂成片段；外切酶又叫纖維二糖水解酶，它可以作用于纖維素的結晶區或小片段纖維素，從糖鏈末端開(kāi)始切掉兩個(gè)葡萄糖分子，產(chǎn)生纖維二糖；葡萄糖苷酶則將纖維二糖分解成葡萄糖。

 

2.兩種剛果紅染色法的比較

剛果紅在篩選纖維素分解菌上的應用已經(jīng)有超過(guò)20年的歷史，在本課題中我們給出了兩種方法。方法一是傳統的方法，缺點(diǎn)是操作繁瑣，加入剛果紅溶液會(huì )使菌落之間發(fā)生混雜；其優(yōu)點(diǎn)是這樣顯示出的顏色反應基本上是纖維素分解菌的作用。方法二的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，不存在菌落混雜問(wèn)題，缺點(diǎn)是由于纖維素和瓊脂、土豆汁中都含有淀粉類(lèi)物質(zhì)，可以使能夠產(chǎn)生淀粉酶的微生物出現假陽(yáng)性反應。但這種只產(chǎn)生淀粉酶的微生物產(chǎn)生的透明圈較為模糊，因為培養基中纖維素占主要地位，因此可以與纖維素酶產(chǎn)生的透明圈相區分。方法二的另一缺點(diǎn)是：有些微生物具有降解色素的能力，它們在長(cháng)時(shí)間培養過(guò)程中會(huì )降解剛果紅形成明顯的透明圈，與纖維素分解菌不易區分。

 

二．實(shí)驗流程

1．土樣的采集

土壤中的微生物，大約70%~90%是細菌。細菌適宜在酸堿度接近中性的潮濕土壤中生長(cháng)，絕大多數分布在距地表約3~8cm的土壤層。因此，土壤取樣時(shí)，一般要鏟去表層土。另外，土樣的采集要選擇富含纖維素的環(huán)境，這是因為在纖維素含量豐富的環(huán)境，通常會(huì )聚集較多的分解纖維素的微生物。綜合各種因素，本小組從圖書(shū)館后院的落葉堆積叢取土樣。

2．選擇培養_富集培養

在將樣品稀釋涂布到鑒別纖維素分解菌的培養基之前，先通過(guò)選擇培養增加纖維素分解菌的濃度，以確保能夠從樣品中分離到所需要的微生物。

富集培養所需要的儀器有：250ml錐形瓶、天平、藥匙、玻璃棒、電爐、搖床、玻璃珠、稱(chēng)量紙等。

 

選擇培養基的制備比例見(jiàn)下：

 

纖維素分解菌的選擇培養基

纖維素粉             5g

NaNO3               1g

Na2HPO4•7H2O       0.5g

KH2PO4                0.9g

MgSO4•7H2O          0.5g

KCl                  0.5g

酵母膏               0.5g

水解酪素             0.5g

將上述物質(zhì)溶解后,用蒸餾水定容到1000ml

按上表比例配制50ml選擇培養基。在250ml錐形瓶中裝入50ml培養基，放5~6顆玻璃珠，用8層紗布做成瓶塞，將瓶口塞緊，再在瓶塞外包裹兩層牛皮紙，用線(xiàn)繩扎緊，在121℃下高壓蒸汽滅菌20min。

稱(chēng)取土樣20g，在無(wú)菌條件下加入裝有50ml培養基的錐形瓶中。將瓶置于搖床上，在30℃下振蕩培養3~4d，至培養基變渾濁。

 

3.梯度稀釋

用量程為1000µL的移液管從富集培養土壤液中吸取1ml土壤懸液加入盛有9ml無(wú)菌水的試管中充分混勻。然后從此試管中吸取1ml加入另一盛有9ml無(wú)菌水的試管中，混合均勻，以此類(lèi)推制成10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6不同稀釋度的土壤溶液。

 

4.剛果紅染色法分離（涂布平板）

（1）鑒別培養基的制備

培養基的制備比例如下：

鑒別纖維素分解菌的培養基

CMC-Na             5-10g

酵母膏               1g

KH2PO4              0.25g

瓊脂                 15g

土豆汁                100ml

將上述物質(zhì)溶解后,用蒸餾水定容到1000ml

按以上比例配制200ml鑒別培養基和10mg/ml的剛果紅（CR）溶液，滅菌后，按照每200ml培養基加入1ml的比例往培養基中加入CR溶液，混勻后倒平板，凝固后待用。

 

涂布平板

將上述已倒培養基的十個(gè)平板底面分別用記號筆寫(xiě)上10-4,10-5,10-6三種稀釋度（每個(gè)稀釋度寫(xiě)3個(gè)）和一個(gè)空白平板（留作對照用）。然后用移液器分別由10-4,10-5,10-6三管土壤稀釋液中各吸取0.1ml對號放入已寫(xiě)好稀釋度的平板中，用無(wú)菌涂布器在培養基表面輕輕地涂布均勻，室溫下靜置5~10min，使菌液吸附進(jìn)培養基。30℃倒置培養，至菌落長(cháng)出，產(chǎn)生纖維素酶的菌落周?chē)鷮��?huì )出現明顯的透明圈。