真菌檢驗技術(shù)的進(jìn)步

真菌檢驗的臨床重要性日益增加。傳統的真菌培養和鑒定技術(shù)需時(shí)較長(cháng)，且深圳特區部真菌感染的病原菌常不易培養成功，成為實(shí)驗診斷的難點(diǎn)。

      近年來(lái)，真菌感染的快速實(shí)驗診斷技術(shù)正在努力解決這一問(wèn)題。一、應用分子生物學(xué)技術(shù)自臨床標本中檢出真菌DNA；二、應用單抗和免疫學(xué)技術(shù)自臨床標本中快速檢出真菌抗原；三、利用真菌的特異性酶快速診斷真菌；四、常規培養與鑒定技術(shù)的進(jìn)步，現分述如下。

 

一、 常規分離、鑒定技術(shù)的進(jìn)步

      利用酵母樣真菌在生長(cháng)過(guò)程中形成的酶，作用于培養基中的色原底物，使菌落呈現不同的顏色，此種CHROMO AGAR的應用，利于快速分離與初步鑒定酵母樣真菌。

      酵母菌的常用鑒定系統已有以AP120C為代表的手工法，以ATB32C為代表的半自動(dòng)法，以AMS（vitek,vitek 2）為代表的自動(dòng)代法借助于A(yíng)MS的YBC卡的生化反應，應用人工雙歧層次分析鑒定法（Dendrogram Hierarchy Process Analytic identification Method,DHPA）可使鑒定正確率提高。

      利用酵母菌生長(cháng)過(guò)程中形成的予成酶（Preformed Enzymes）作用于合成的色原底物而制成的成套微量鑒定系統Rap ID Yeast plus System(RYP,美國Innovative Diagnostic System公司)，可于4小時(shí)完成酵母菌的快速鑒定，與應用API20C的一致率達97.3%。

      平滑念株菌可利用其快速分解菌藻糖（Trehalose）而迅速鑒定。用4%菌藻糖的0.1μmol/L枸櫞酸緩沖液，取待鑒定菌落濃涂入液中，37℃溫育3h，以尿葡萄糖試紙檢測，如在2分鐘內顯色（陽(yáng)性）即為平滑念珠菌。經(jīng)與傳統鑒定方法比較，此法的敏感性98.8%,特異性99.1%.

      都柏林念珠菌的臨床重要性在增長(cháng)，其簡(jiǎn)易可靠的鑒定試驗為該菌在42℃不能生長(cháng)，且β-D葡萄苷酶為陰性。

二、 自臨床標本中直接檢查抗原

      深部真菌感染者血中難于培養出菌體，尤其是絲狀真菌菌體常粘附、纏繞于組織，血中不易出現。但組織中菌體可溶性抗原可吸收入血自血、尿或感染組織液中直接檢查真菌抗原為快速診斷的重要手段；雖也可檢查抗體，但難達快速診斷。

（一）、檢測念球菌屬的甘露聚糖及其抗原

1．膠乳凝集試驗（Sanofi Diagnostics Pasteur公司）

取300μl血清，加100μlEDTA處理液，混勻，煮沸3min，離心10000×g10min，取上清40μl加10μlSanofi膠乳粒子，3min內出現凝集為陽(yáng)性。

2． EIA法。以單抗包被酶標板，用雙抗體夾心法檢查血清中念球菌抗原（Behring Diagrostics公司試劑）

3．檢測血中的白色念球菌的甘露聚糖抗體。ENA法檢查中甘露聚糖對念珠菌感染的診斷敏感性40%，特異性98%，ENA法檢查甘露聚糖抗體對念珠菌感染的診斷敏感性53%,特異性94%。

4．檢查血清中D-阿拉醇或D-阿拉伯醇與L-阿拉伯醇的比值可快速診斷念珠菌病。Yeo等用基因重組的D-阿拉伯醇脫氫酶以酶熒光法定量，發(fā)現念珠菌感染者血清中來(lái)自菌體的D-阿拉伯醇明顯升高，用此法迅速論斷新生兒的侵襲性念珠菌病。

Mitsutake等比較了自39名深部念珠菌病患者血液中檢出抗原的四種方法。應用斑點(diǎn)印跡法檢查其烯醇化酶（Enlase）抗原的陽(yáng)性率71.8%，特異性100%；應用膠乳凝集檢查熱敏性糖蛋白抗原陽(yáng)性率76.9%，特異性87.5%；應用膠乳凝集檢查甘聚糖抗原陽(yáng)性率75.6%，特異性100%，應用鱟試試驗檢查細胞壁組分β-Glucan的陽(yáng)性率84.4%，特異性87.5%。

（二）、肺曲菌病的血清抗原檢查

1．膠乳凝集試驗（Pastorex Aspergillus,法國Sanofi公司）檢查血清中半乳甘露聚糖（Galactomannan）。方法如上述膠乳凝集試驗。

2．單抗ELISA法檢查血清中半乳甘露聚糖抗原（法國Sanofi公司），敏感性達1.0ng/ml。

3． DELFIA法。Eu標記的時(shí)間分辨熒光分析法（芬蘭Wallac公司試劑）敏感性達0.5ng/ml。

（三）、血清中查組織胞漿菌抗原

以此菌莢膜的69-70kd抗原制出單抗以ELISA法檢出可及時(shí)明確診斷。

（四）、尿中檢查馬尼菲青霉菌抗原

以該菌外壁的膜蛋白為抗原制出單抗，以ENA法診斷33例患者，52例健康人和248例無(wú)真菌感染的住院患者均為陰性。本法的特異性98%，敏感性97%，陽(yáng)性予示值84%，陰性予示值99.7%。

（五）、新形隱球菌的抗原檢查

新形隱球菌具有莢膜多糖抗原，可以單抗致敏的膠乳凝集試驗快速檢出。其莢膜多糖的主要成分為Glucuronoxylomannan，以此抗原的單抗包被酶標板，以雙抗體夾心法檢出抗原，血清稀釋1：8為陽(yáng)性。Feldmesset用此法自AIDS患者引發(fā)新形隱球菌性腦膜炎的血清中檢出抗原而及時(shí)診斷。

（六）、深部絲狀真菌感染的抗原檢查。

絲狀真菌的細胞壁成分含（1→3）β-D葡聚糖，可用鱟試劑（鱟凝固酶）檢出。以20μg/ml為界限值。文獻報告檢查41例深部絲狀真菌感染者，37例陽(yáng)性，敏感率90%，特異性100%。

三、 檢查真菌的特異性酶

白色念珠菌具N-乙酰-β-D半乳糖苷酶和脯氨酸氨肽酶，如用適當底物檢測，此兩酶同時(shí)陽(yáng)性，即可確定。都柏林念珠菌只具N-乙酰-β-D半乳糖苷酶�？巳崮钪榫�具酸性磷酸酶，熱帶念珠菌具吡咯磷酸酶，平滑、副平滑念珠菌具β-D半乳糖苷酶，新形隱球菌具酚氧酶，均可用適當呈色底物快速完成鑒定。

四、 分子生物學(xué)技術(shù)

（一）、用PCR等技術(shù)字標本中擴增真菌DNA。國內應用PCR與反向斑點(diǎn)雜交快速檢測及鑒定念珠菌主要種別。國外可以用PCR-DEIA技術(shù)從血清中擴增出白色念珠菌的DNA來(lái)診斷念珠菌病。

針對真菌的共同序列而設計的‘全能引物’（pan-primer）而擴增580bp的產(chǎn)物，為真菌所共有。檢測血液標本即可明確體內有無(wú)真菌感染。

（二）、用于真菌的型別分析。國內應用隨機引物PCR擴增后進(jìn)行真菌分型，結果可靠。應用隨機引物擴增物多態(tài)性分析（RAPD）可以將5種曲霉菌鑒別開(kāi)（煙、黃、黑、土、構巢曲霉）。國外結合PCR與酶標記探針在紙條上進(jìn)行檢測（LiPA,line probe assay）可鑒別出主要的致病性真菌。

（三）、檢出念珠菌的基因變異快速確定念珠菌對酮康唑的耐藥性。此種耐藥性由基因的1554T突變?yōu)镃而致，應用Lightcycler儀器，以熒光共振能量轉移和基因片段溶解溫度曲線(xiàn)技術(shù)測定。