植物組織培養技術(shù)基礎

植物組織培養（Plant tissue culture）技術(shù)，是20世紀興起的一項植物細胞工程技術(shù)。它的基本內容是：從外界植物體上取下任意的一個(gè)到幾個(gè)細胞或者一塊組織在全人工的離體條件下進(jìn)行培養，經(jīng)過(guò)細胞或者組織的分裂、分化及幾何增殖達到植株的形態(tài)重建和快速繁殖的目的。

 

     植物細胞具有全能性，即任何一個(gè)植物細胞都具有形成該植物體的能力。換言之，任何一個(gè)高度分化的細胞都具有回復到原始未分化細胞的能力，并且能分化為其他形式的高分化細胞。`這種“全能性”就是植物組織培養的理論基礎。我們依據植物細胞的這種特性，可以任意的使植物體的任何一個(gè)高分化的細胞經(jīng)過(guò)脫分化培（Dedifferentiationculture）,形成原始干細胞團，或者稱(chēng)之為愈傷組織（Cellus），將得到的愈傷組織經(jīng)過(guò)一定的的培養途徑，這種低分化細胞開(kāi)始分化，逐步形成各種高分化細胞，這個(gè)過(guò)程稱(chēng)為植物細胞的再分化（Redifferentiation）。再分化后的植物細胞即可形成宏觀(guān)形態(tài)上的芽和根，至此該種植物的離體繁殖系宣告建成。

   

    將得到的該種植物的離體繁殖系經(jīng)過(guò)反復的分離和微扦插，即可達到幾何數級的增殖，此過(guò)程就是所謂的快速微繁殖或者快速繁殖（Rapid propagation）。植物快速繁殖通常是在離體繁殖系建成之后進(jìn)行，有時(shí)也可以將愈傷組織進(jìn)行快速增殖，此時(shí)通常采用液體懸浮培養。若該種植物能形成球狀胚體（Embryois），則又常常把快速繁殖階段選定在球胚的增殖�？傊�，只要能達到快速繁殖的目的，用作快繁的階段可以隨意選擇。

   

     植物組織培養的成功與否取決于外植體的制備、無(wú)菌操作和人工培養環(huán)境。外植體的制備是能否建成離體繁殖系要過(guò)的第一關(guān)。所謂的外植體是指將外界生長(cháng)的植物的細胞和組織經(jīng)過(guò)一系列的無(wú)菌處理形成的有活性的無(wú)菌組織和細胞。習慣上我們經(jīng)常使用化學(xué)藥劑處理，例如氯化汞、次氯酸鹽或者抗生素等。將從母株上取下的組織進(jìn)行一定的剝離和分割，經(jīng)過(guò)流水沖洗數分鐘，再浸入適宜濃度的化學(xué)藥劑中一段時(shí)間，最后經(jīng)無(wú)菌水沖洗并適當分割即成外植體。制備外植體的原則是無(wú)菌和有活性，無(wú)菌是外植體植被的要求，有雜菌帶入培養基會(huì )造成微生物污染，而阻滯甚至殺死外植體。有活性是外植體制備的前提，無(wú)活性的外植體的培養在植物組織培養中是無(wú)意義的。

   

     無(wú)菌操作是貫穿于整個(gè)組織培養過(guò)程的一門(mén)關(guān)鍵技術(shù)，甚至可以說(shuō)組織培養的前提就是無(wú)菌。事實(shí)上外植體的制備過(guò)程就是無(wú)菌處理過(guò)程，而其后的一系列操作都是在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行的，實(shí)驗室中經(jīng)常使用的無(wú)菌操作設備是超凈工作臺。超凈工作臺通常借助紫外光結合逆壓滲透的超濾風(fēng)技術(shù)來(lái)滿(mǎn)足無(wú)菌要求。無(wú)菌操作者的操作手法和習慣也是無(wú)菌操作成功與否的關(guān)鍵，通常進(jìn)行無(wú)菌操作的實(shí)驗人員也要經(jīng)過(guò)嚴密的無(wú)菌操作訓練并建立嚴格的“無(wú)菌概念”。

 

     能否把植物組織培養做到滿(mǎn)意的人工調控，關(guān)鍵在于人工培養環(huán)境。人工培養環(huán)境是整個(gè)組織培養的難點(diǎn)和重點(diǎn)，也是近百年來(lái)植物生理學(xué)家一直探討和研究的重要話(huà)題。人工培養環(huán)境包括能量的來(lái)源——光照，新陳代謝的保證——溫度，氣-水平衡——濕度，生物原料的來(lái)源——培養基。這與植物的自然環(huán)境是類(lèi)似的，即光照、溫濕度和土壤。光照、溫度的選定通常依據所培養植物的生態(tài)習性，習慣上采用暗培養與光照培養(8h/d,3000lx)的結合，溫度在25-28度。濕度在組織培養中不需特意的調整，因為培養容器中的濕度幾乎達到100%.如此說(shuō)來(lái)，人工培養環(huán)境的重難點(diǎn)自然而然地落在了培養基上。

   

 培養基(Culture medium)是從無(wú)土栽培的營(yíng)養液發(fā)展而來(lái)的，在某種意義上說(shuō)就是模擬土壤。最初的培養基就是簡(jiǎn)單的馬鈴薯浸出液即土豆汁。后來(lái)隨著(zhù)植物生理學(xué)和生物化學(xué)的研究的深入，培養基越來(lái)越復雜，成分越來(lái)越多。當支持物(如：瓊脂、明膠)的發(fā)現并且應用到培養基的培養基中時(shí)，固體培養基隨之誕生。固體培養基是組織培養基中最常用的一種培養基的類(lèi)型。人工合成培養基通常包括大量元素、微量元素、鐵鹽、有機復合物、糖、支持物和植物激素。大量元素和微量元素通常使用無(wú)機鹽代替，鐵鹽通常以螯合鐵的形式出現，有機復合物通常包括氨基酸、代謝載體和維生素等，糖可采用蔗糖或者葡萄糖，支持物一般采用高分子交聯(lián)糖鏈(如聚半乳糖硫酸酯)，這幾類(lèi)物質(zhì)的用量和配比在多少年的發(fā)展中已經(jīng)基本上形成了若干個(gè)模板，例如實(shí)驗室中常用的MS 、B5、Nicher培養基。

   

植物激素，是植物組織培養中發(fā)揮生物學(xué)效力最強的培養因素，也是人工調控組織培養的“魔術(shù)棒”。幾乎所有的植物組織培養工作者都認同植物激素在組織培養中具有無(wú)可動(dòng)搖的核心地位。植物激素包括五大類(lèi)：生長(cháng)素類(lèi)、細胞分裂素類(lèi)、赤霉素、乙烯類(lèi)和生長(cháng)抑制素類(lèi)。在植物組織培養中最常用的是生長(cháng)素和細胞分裂素。生長(cháng)素與細胞分裂素的協(xié)同調控作用在組織培養中很重要，即所謂的“激素杠桿”。例如：生長(cháng)素生物學(xué)效應高于細胞分裂素時(shí)，誘導植物組織脫分化和根原基的形成；細胞分裂素的效應高于生長(cháng)素時(shí)，誘導植物組織再分化和芽原基的形成。生長(cháng)素包括很多種，如1-奈乙酸、吲哚乙酸和2，4-D等，它們的生物學(xué)效應有著(zhù)微妙的不同，但總體效應是一致的。細胞分類(lèi)素也是如此，包括6-芐基腺嘌呤、6-糠氨基嘌呤和玉米素等。植物激素在培養基中的用量通常在0.01-10mg/L(ppm).之間變化，細胞分裂素的濃度在非生根培養中要大于生長(cháng)素。值得指出的是，植物激素的用量要考慮組織內源激素的含量及其生理學(xué)周期效應。換言之，激素的生物學(xué)效應是組織內源激素和人工添加的外源激素效應的總和。只有準確把握內源激素與外源激素的協(xié)同作用，才能有效地操作“激素杠桿”，用好植物激素這根“魔術(shù)棒”，做好植物組織培養。

   

 當應用組織培養技術(shù)建成了某種植物的整體形態(tài)，即得到了有莖、根、葉的苗子，要經(jīng)歷一定的煉苗處理，使之逐步由無(wú)菌環(huán)境到有菌環(huán)境，由人工培養環(huán)境過(guò)渡到自然環(huán)境。習慣上是采用“過(guò)渡處理法”，即逐漸地使環(huán)境改變，如出瓶苗要使用消毒的土壤、保濕、保溫，同時(shí)還要做一定的壯苗處理，如增加光照和補充營(yíng)養液等。經(jīng)過(guò)一系列的處理，一株組織培養出來(lái)的“克隆苗”就順利成活了。

 

植物組織培養技術(shù)，是植物細胞工程學(xué)、遺傳學(xué)、植物生理學(xué)、生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究的重要基本技術(shù)。也就是說(shuō)，植物組織培養技術(shù)不僅僅用于快速繁殖，而是有著(zhù)相當廣泛的用途。例如：?jiǎn)伪扼w育種、種質(zhì)保存、生理學(xué)研究和基因轉化等等。近年來(lái)，組織培養技術(shù)日趨完善，但仍然存在很大的不足和有待改善的方面，這就需要廣大的科學(xué)工作者和組織培養的愛(ài)好者的共同努力。目前，組培快繁技術(shù)在蘭花等觀(guān)賞花卉中基本實(shí)現了工廠(chǎng)化育苗，由此可見(jiàn)其應用前景的光明�？紤]到技術(shù)與產(chǎn)業(yè)之間的距離，切忌盲目建立大規模的組織培養室，在某一種植物工廠(chǎng)化育苗系統的建立之前一定要充分審視各相關(guān)要素，權衡利弊后再行建設，以減少無(wú)謂的投入。