結核分支桿菌檢驗

 結核分支桿菌檢驗
 Mycobacterium tuberculosis

 

一、結核分支桿菌與結核病

n結核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis)俗稱(chēng)結核桿菌，屬于分枝桿菌屬(Mycobacterium)，可引起人和牛(主要是奶牛)、豬、禽類(lèi)的結核病。該菌屬是一類(lèi)細長(cháng)略彎曲的微生物，有時(shí)有分枝或出現絲狀體。目前在分類(lèi)學(xué)上已將分枝桿菌屬歸納于放線(xiàn)菌中。主要有人型、牛型、禽型、鼠型和冷血動(dòng)物型及非洲型。已知人型、牛型和非洲型對人有致病性。禽型可能也對人致病。

n牛，特別是奶牛對結核桿菌最易感。牛常見(jiàn)的結核病是肺、乳房、淋巴結結核，有時(shí)可見(jiàn)腸、生殖器、漿膜結核及全身性結核。豬主要表現為淋巴結核，最�；疾〉牟课皇穷M下、咽、頸及腸系膜淋巴結。禽類(lèi)主要對禽型結核桿菌敏感，主要侵害肝、脾等。

n人的結核以肺結核最為常見(jiàn)，此外有淋巴結核、腸結核、骨結核等。據WHO報道，每年約有800萬(wàn)新病例發(fā)生，至少有300萬(wàn)人死于該病。人感染結核病，除通過(guò)呼吸道途徑外，還可通過(guò)動(dòng)物性食品尤其是污染的牛乳經(jīng)消化道而感染，病畜肉對人也有一定威脅。因此，牛乳或肉食品中的結核桿菌污染以及奶牛等畜禽的結核病在食品衛生方面具有重要意義，是預防人類(lèi)結核病的重要環(huán)節。

nIn 1882, a few years after he discovered the bacillus responsible for anthrax, German physician Robert Koch (1843-1910) published his studies revealing the organism behind TB, Mycobacterium tuberculosis.  Suddenly, contaminated raw  milk, and it's role in infant ,mortality, became a lot  clearer.

 

二、生物學(xué)特性

(一)形態(tài)與染色特性

n結核分枝桿菌為細長(cháng)略帶彎曲、兩端鈍圓的桿菌，長(cháng)1～4μm，寬0.2～0.5μm。牛分枝桿菌則比較粗短。無(wú)芽孢，無(wú)動(dòng)力。在陳舊培養物或干酪化的淋巴結中可看到分枝狀。分枝桿菌屬的細菌細胞壁脂質(zhì)含量較高，約占干重的60%，特別是有大量分枝菌酸(mycolic acid)包圍在肽聚糖層的外面，可影響染料的穿入，若經(jīng)加溫或延長(cháng)染色時(shí)間而著(zhù)色后能抵抗強脫色劑鹽酸乙醇的脫色，故又稱(chēng)抗酸桿菌(acid-fast bacilli)。分枝桿菌一般用齊尼(Ziehl-Neelsen)抗酸染色法，以5% 石炭酸復紅加溫染色后可以染上，但用3%鹽酸乙醇不易脫色。若再加用美藍復染，則分枝桿菌呈紅色，而其他細菌和背景中的物質(zhì)為藍色。

n近年發(fā)現結核分枝桿菌在細胞壁外尚有一層莢膜。一般因制片時(shí)遭受破壞而不易看到。若在制備電鏡標本固定前用明膠處理，可防止莢膜脫水收縮。在電鏡下可看到菌體外有一層較厚的透明區，即莢膜，莢膜對結核分枝桿菌有一定的保護作用。

(二)培養特性

n結核分支桿菌專(zhuān)性需氧。最適溫度為37℃，低于30℃不生長(cháng)。對營(yíng)養要求較高，必須在含有血清或卵黃、某些無(wú)機鹽和碳源(葡萄糖、甘油及丙酮酸鈉)的特殊培養基上才能生長(cháng)。即使在最適條件下生長(cháng)仍很緩慢，需10～20d才能在固體培養基上出現可見(jiàn)菌落。常用的有羅氏(Lowenstein-Jensen)固體培養基，內含蛋黃、甘油、馬鈴薯、無(wú)機鹽和孔雀綠等�？兹妇G可抑制雜菌生長(cháng)，便于分離和長(cháng)期培養。蛋黃含脂質(zhì)生長(cháng)因子，能刺激生長(cháng)。菌落為淺黃色，小而干燥，不透明，表面粗糙、皺縮，形似菜花心。在液體培養基中一般1～2周即可生長(cháng)，可形成菌膜，加入吐溫-80(Tween-80)等表面活性劑，則可提高細菌生長(cháng)率，并使其均勻生長(cháng)。

(三)生化特性

各型結核桿菌均不發(fā)酵糖類(lèi)，人型和牛型菌株能產(chǎn)生尿素酶。人型菌株還可還原硝酸鹽，能產(chǎn)生煙酸。結核分枝桿菌大多數觸酶試驗陽(yáng)性，而熱觸酶試驗陰性。人結核分支桿菌和牛分支桿菌、鳥(niǎo)分支桿菌的特性比較見(jiàn)表6-3-1。

(四)抵抗力

n本菌對干燥的抵抗力特別強。粘附在塵埃上保持傳染性8～10d，在干燥痰液中可存活6～8個(gè)月。結核分支桿菌細胞壁中含有脂質(zhì)，故對乙醇敏感，在70%乙醇中2min死亡。結核桿菌對紫外線(xiàn)敏感，直接日光照射數小時(shí)可被殺死，可用于結核患者衣服、書(shū)籍等的消毒。對常用消毒劑如石炭酸有較強的抵抗力。在4%NaOH(W/V)、3%HCl(W/V)或6%硫酸(W/V)中30min活力不受影響(因此可用此法進(jìn)行有雜菌污染檢樣的預處理)。對濕熱敏感，經(jīng)60℃、30min或80℃、5min死亡，巴氏消毒法可有效殺死本菌。結核桿菌對1﹕13 000孔雀綠有抵抗力，加在培養基中可抑制雜菌生長(cháng)。

 

三、檢驗

一)結核桿菌的常規檢驗      包括顯微鏡檢查、細菌培養、動(dòng)物試驗、結核菌素試驗等。

1. 顯微鏡檢查

n用檢樣制涂片，進(jìn)行齊-尼氏抗酸染色和革蘭氏染色，鏡檢。若被檢材料是痰液或病灶，則檢出革蘭氏陽(yáng)性的抗酸菌即可初步判斷；而在牛乳、糞便、尿液中檢出抗酸菌，必須再進(jìn)一步鑒定。

    2. 細菌檢查

n(1)濃縮集菌：先集菌后檢查，可提高檢出率。腦脊液和胸、腹水無(wú)雜菌，可直接離心沉淀集菌。痰、支氣管灌洗液、尿、糞等污染標本需經(jīng)4% NaOH(痰和堿的比例為1:4,尿、支氣管灌洗液和堿的比例為1:1)處理15min。尿標本先加5% 鞣酸、5% 乙酸各0.5ml于錐形量筒內靜置，取沉淀物處理。處理后的材料再離心沉淀。取沉淀物作涂片染色鏡檢。若需進(jìn)一步作培養或動(dòng)物接種，應先用酸中和后再離心沉淀。

n(2)固體培養法：取檢樣接種于固體培養基，分別置暗處和有光處，37℃培養4～8周后觀(guān)察。根據生長(cháng)快慢、菌落特性、色素產(chǎn)生情況及抗酸性強弱做出判斷。如培養特性不典型，則須進(jìn)一步鑒定。

n(3)玻片培養法：檢樣經(jīng)濃縮集菌后，涂布于滅菌小玻片上(不固定)，置于有血液或血清的液體培養基中，37℃培養5～7d，取出染色檢查。

    3. 動(dòng)物試驗    分離細菌、測定毒力及分型時(shí)均可應用。常用豚鼠或地鼠。將檢樣注射于腹股溝皮下，3～4周后如發(fā)現局部淋巴結腫大或結核菌素試驗陽(yáng)性，即可剖檢，觀(guān)察淋巴結、肺、肝等臟器有無(wú)病變，并進(jìn)行涂片染色鏡檢及細菌培養。動(dòng)物接種的陽(yáng)性率較染色鏡檢和細菌培養高，但耐異煙肼菌株毒力明顯減弱，會(huì )影響實(shí)驗結果。若6～8周仍不見(jiàn)發(fā)病，也應進(jìn)行解剖檢查。

4. 結核菌素試驗   

作為診斷結核病的方法，在人只適于嬰幼兒；在動(dòng)物檢疫中多應用于牛，雞和其它動(dòng)物必要時(shí)也可應用。

結核菌素試驗是牛結核病檢疫時(shí)的主要方法，有皮內法、點(diǎn)眼法和皮下法3種。最好將前兩種方法同時(shí)并用，即用舊結核菌素(old tuberculin，OT)或純蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)同時(shí)進(jìn)行皮內注射和點(diǎn)眼。根據注射部位的熱痛、腫脹等炎癥反應，以及眼結膜反應、眼瞼腫脹狀態(tài)和眼分泌物的質(zhì)與量進(jìn)行判斷。皮內接種和點(diǎn)眼任一方法呈陽(yáng)性，即為結核菌素試驗陽(yáng)性。

    禽類(lèi)檢疫時(shí)，用禽型結核菌素0.1mL注射于雞的肉垂內，以48h出現腫脹和發(fā)紅為陽(yáng)性。

二)其它檢驗方法

    1. 熒光染色法    將檢樣涂片固定，然后用0.1%金胺石炭酸溶液染色，再用3%鹽酸酒精脫色，最后以美蘭飽和酒精溶液復染，于熒光顯微鏡下檢查。若視野中有黃綠色明亮熒光的桿菌，即可作初步判斷。該法比常規抗酸染色法檢出率高。

2. 生化試驗    生化試驗是鑒定結核桿菌的快速方法。主要包括煙酸試驗、硝酸鹽還原試驗、過(guò)氧化氫酶試驗、尿素酶試驗及β-葡萄糖苷酶試驗等。

3. 血清學(xué)試驗    血清學(xué)方法如間接血凝試驗、ELISA、放射免疫測定、免疫熒光等，其中ELISA是目前檢測結核病抗體的最好方法，對人的活動(dòng)性結核檢出率為55%～90%，對動(dòng)物結核的檢出率為50%～60%。

4. PCR快速診斷　　一般涂片檢查菌數需5´103～5´104/mL，培養需1´102/mL，少于此數時(shí)不易獲得陽(yáng)性結果，且培養需時(shí)較長(cháng)。目前已將多聚酶鏈反應(PCR)擴增技術(shù)應用于結核分枝桿菌DNA鑒定，每毫升中只需含幾個(gè)細菌即可獲得陽(yáng)性結果，且1～2d得出結果。