微生物常規鑒定技術(shù)

微生物常規鑒定技術(shù)

一、形態(tài)結構和培養特性觀(guān)察

1、微生物的形態(tài)結構觀(guān)察

微生物的形態(tài)結構觀(guān)察主要是通過(guò)染色，在顯微鏡下對其形狀、大小、排列方式、細胞結構(包括細胞壁、細胞膜、細胞核、鞭毛、芽孢等)及染色特性進(jìn)行觀(guān)察，直觀(guān)地了解細菌在形態(tài)結構上特性，根據不同微生物在形態(tài)結構上的不同達到區別、鑒定微生物的目的。

2、微生物培養特性觀(guān)察

革蘭染色法，丹麥病理學(xué)家C.Gram 1884年創(chuàng )立(1)涂片 (2)晾干 (3)固定 (4)結晶紫色染色：1min。水洗 (5)媒染：滴加盧哥氏碘液，媒染1min。水洗(6) 脫色：將玻片傾斜，連續滴加95%乙醇脫色20～25s至流出液無(wú)色，立即水洗�！�(7) 復染：滴加蕃紅復染5min。水洗(8) 晾干：晾干或者用吸水紙吸干�！�(9) 鏡檢：先用低倍，再用高倍，最后用油鏡�！�(10)實(shí)驗完畢后的處理：①浸過(guò)油的鏡頭：a.先用擦鏡紙將油鏡頭上的油擦去。b.用擦鏡紙沾少許二甲苯將鏡頭擦2～3次。c.再用干凈的擦鏡紙將鏡頭擦2～3次。注意擦鏡頭時(shí)向一個(gè)方向擦拭。②細菌染色玻片用廢擦鏡紙將香柏油擦干。

微生物培養特性的觀(guān)察是微生物檢驗鑒別中的一項重要內容。

1)細菌的培養特征    包括以下內容：在固體培養基上，觀(guān)察菌落大小、形態(tài)、顏色(色素是水溶性還是脂溶性)、光澤度、透明度、質(zhì)地、隆起形狀、邊緣特征及遷移性等。在液體培養中的表面生長(cháng)情況(菌膜、環(huán))混濁度及沉淀等。半固體培養基穿刺接種觀(guān)察運動(dòng)、擴散情況。

2)霉菌酵母菌的培養特征：大多數酵母菌沒(méi)有絲狀體，在固體培養基上形成的菌落和細菌的很相似，只是比細菌菌落大且厚。液體培養也和細菌相似，有均勻生長(cháng)、沉淀或在液面形成菌膜。

霉菌有分支的絲狀體，菌絲粗長(cháng)，在條件適宜的培養基里，菌絲無(wú)限伸長(cháng)沿培養基表面蔓延。霉菌的基內菌絲、氣生菌絲和孢子絲都常帶有不同顏色，因而菌落邊緣和中心，正面和背面顏色常常不同，如青霉菌：孢子青綠色，氣生菌絲無(wú)色，基內菌絲褐色。霉菌在固體培養表面形成絮狀、絨毛狀和蜘蛛網(wǎng)狀菌落。

二、生理生化試驗

微生物生化反應：指用化學(xué)反應來(lái)測定微生物的代謝產(chǎn)物，生化反應常用來(lái)鑒別一些在形態(tài)和其它方面不易區別的微生物。因此微生物生化反應是微生物分類(lèi)鑒定中的重要依據之一。

微生物檢驗中常用的生化反應有：

糖或醇類(lèi)發(fā)酵試驗       淀粉水解試驗       V-P試驗       甲基紅(MR)試驗          靛基質(zhì)(Indole)試驗    

過(guò)氧化氫酶試驗        硝酸鹽還原試驗     明膠液化試驗   尿素酶(Urease)試驗         氧化酶試驗              

硫化氫(H2S)試驗   三糖鐵(TSI)瓊脂試驗    氨基酸脫羧酶的測定    耐鹽性試驗      卵磷脂酶的測定

石蕊牛奶反應           酪蛋白水解      苯丙氨酸脫氨試驗       氰化鉀試驗            對疊氮化鈉的抗性　　　　　

硫化氫-靛基質(zhì)-動(dòng)力(SIM)瓊脂試驗        含碳化合物的利用(檸檬酸鹽或丙酸鹽利用)

三、血清學(xué)試驗

血清學(xué)反應是指：相應的抗原與抗體在體外一定條件下作用，可出現肉眼可見(jiàn)的沉淀、凝集現象。在食品微生物檢驗中，常用血清學(xué)反應來(lái)鑒定分離到的細菌，以最終確認檢測結果。

在細菌的檢測中，應用最多的是凝集試驗、沉淀反應和補體結合試驗。

血清學(xué)試驗的一般特點(diǎn)：

1)抗原體的結合具有特異性，當有共同抗原體存在時(shí)，會(huì )出現交叉反應。

2)抗原體的結合是分子表面的結合，這種結合雖相當穩定，但是可逆的。

3)抗原體的結合是按一定比例進(jìn)行的，只有比例適當時(shí)，才能出現可見(jiàn)反應。

4)血清學(xué)反應大體分為兩個(gè)階段進(jìn)行，但其間無(wú)嚴格界限。第一階段為抗原體特異性結合階段，反應速度很快，只需幾秒至幾分鐘反應即可完畢，但不出現肉眼可見(jiàn)現象。第二階段為抗原體反應的可見(jiàn)階段，表現為凝集、沉淀、補體結合反應等。反應速度慢，需幾分、幾十分以至更長(cháng)時(shí)間。而且，在第二階段反應中，電解質(zhì)、PH、溫度等環(huán)境因素的變化，都直接影響血清學(xué)反應的結果。

1、凝集反應(Agglutination reaction)

顆粒性抗原(細菌、紅細胞等)與相應抗體結合，在電解質(zhì)參與下所形成的肉眼可見(jiàn)的凝集現象，稱(chēng)為凝集反應。其中的抗原稱(chēng)為凝集原，抗體稱(chēng)為凝集素。在該反應中，因為單位體積抗體量大，做定量實(shí)驗時(shí)，應稀釋抗體。

1)直接凝集反應：a. 玻片凝集法； b. 試管凝集法       2)間接凝集反應

2、沉淀反應(Precipitation test)

可溶性抗原與相應抗體結合，在有適量電解質(zhì)存在下，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間，形成肉眼可見(jiàn)的沉淀物，稱(chēng)為沉淀反應。反應中的抗原稱(chēng)為沉淀原，抗體為沉淀素。由于在單位體積內抗原量大，為了不使抗原過(guò)剩，故應稀釋抗原，并以抗原的稀釋度作為沉淀反應的效價(jià)。

1)環(huán)狀沉淀反應 2)絮狀沉淀反應3)瓊脂擴散試驗

3、補體結合反應(Complement fixation reaction)

補體結合反應是在補體參與下，以綿羊紅細胞和溶血素作為指示系統的抗原抗體反應。補體無(wú)特異性，能與任何一組抗原抗體復合物結合而引起反應。如果補體與綿羊紅細胞、溶血素的復合物結合，就會(huì )出現溶血現象; 如果與細菌及相應抗體復合物結合，就會(huì )出現溶菌現象。因此，如果出現溶菌，說(shuō)明抗原抗體是相對應的(試驗結果陽(yáng)性)；如果出現溶血，說(shuō)明抗原抗體不相對應(陰性)。

此反應操作復雜，敏感性高，特異性強，能測出少量抗原和抗體，所以應用范圍較廣。

其它方法：熒光抗體技術(shù),   ELISA,   免疫組化