乳粉中阪崎腸桿菌的檢測方法（2）

阪崎腸桿菌在EMB瓊脂平板上呈紫紅色粘液狀，菌落較大，相鄰菌落之間易于融合。 在Mac—conKev脂平板上大小約2～3 mm, 呈淡粉色。在SorbitolMacConKey瓊脂平板上 不發(fā)酵山梨醇．形成中等大小、圓形突起、邊緣整齊的淡黃色菌落。

選擇在sorbitolMacConKey瓊脂平板上挑取單個(gè)菌落接種TSA斜面． 阪崎腸桿菌在 36℃+1℃條件下培養18-24 h．能形成較明顯的色素。

2．2．1 形態(tài)與染色

革蘭氏染色鏡檢為G- 無(wú)芽孢短桿菌．呈球桿狀或成對排列．有時(shí)亦可呈短鏈狀。

2．2．2  生化特性

菌株觸酶陽(yáng)性、氧化酶陰性、動(dòng)力陽(yáng)性、葡萄糖代謝類(lèi)型 (0／F)為發(fā)酵型( F )，IMViC： 靛基質(zhì)陰性、MR陰性、vP陽(yáng)性、檸檬酸鹽陽(yáng)性，在TSA斜面上產(chǎn)黃色色素，做進(jìn)一步進(jìn)行生化鑒定，結果如表1所示。   

 

本次實(shí)驗室分離2株阪崎腸桿菌。菌株0819 -041生化反應與標準菌株有不同之處：①衛矛醇陽(yáng)性。阪崎腸桿菌此項生化反應陽(yáng)性的僅占0—9％的機率^［4］。②苦可仁甙陰性．此項生化反應是陽(yáng)性．此項結果陰性目前還未見(jiàn)報道。③明膠酶陽(yáng)性，明膠酶是胞外蛋白酶的一種．大部分細菌則沒(méi)有這種能力一般梭狀菌、芽孢桿菌、變形桿菌、 假單胞菌具有胞外蛋白酶．使明膠分解而失去凝固力．阪崎腸桿菌明膠酶陽(yáng)性機率很少。④乳糖為遲緩發(fā)酵 (72h )，陰溝腸桿菌會(huì )出現乳糖遲緩發(fā)酵現象．分析此現象與朱永紅報道的阪崎腸桿菌與陰 溝腸桿菌有31％-49％DNA 序列同源^［3］性有關(guān)。 菌株0819 - -041經(jīng)北京藥品生物制品檢定所依據《伯杰細菌鑒定手冊》第9版對其進(jìn)行鑒定，確認阪崎腸桿菌。

兩種修復培養及培養基靈敏度比較結果如表2所示

 

 

表2中，在溫 度 為 36℃ ±1℃ 條 件 下 培 養 時(shí) 間 均 為 18 ～24  h。 

取2～8℃冰箱保 個(gè)月的阪崎腸桿菌斜面直接制備菌懸液。觀(guān)察修復培養生長(cháng)情況，試 驗結果表明：分別取0．1ml涂布普通營(yíng)養瓊脂平板，經(jīng)36℃±1℃培養18-24h．未生長(cháng)阪崎腸桿菌。經(jīng)修復培養及腸道增菌培養后．A和B兩組均能在5種分離培養基上生長(cháng)，B組比A組修復培養靈敏度高出1個(gè)稀釋度(10倍)。

2．4 生物學(xué)特征及生長(cháng)情況

阪崎腸桿菌在5種分離培養基上生物學(xué)特征及生長(cháng)情況比較結果如表3所示 

 

 注：+為陽(yáng)性；-為陰性。

 

用2％NutirentAgar與5種腸道分離培養基比較．Sorbitol Mac ConKey，MacConKey，Xa—GicA培養基上菌落生長(cháng)數量基本相接近<10％。無(wú)統計學(xué)差異。Xa—GicA上菌落呈藍綠色，選擇性強，但菌落生長(cháng)較小。在 MB和VRB—GA瓊脂平板上阪崎腸桿菌都呈紫紅色黏液 狀．由于有融合生長(cháng)情況．菌落數量有明顯差異。

3．1菌株分離要點(diǎn)

選擇分離培養基最好選用弱選擇性和強選擇性培養基各1種或鑒別培養基進(jìn)行分離養．增 加分離平板種類(lèi)以及從分離平板上挑選多個(gè)可疑菌落進(jìn)行鑒定。阪崎腸桿菌為腸桿菌科、腸 桿菌屬革蘭氏陰性無(wú)芽孢短桿菌。因此，選擇了3種常用的腸道分離培養基．凡是腸桿菌科 的細菌都能在此平板上生長(cháng)。EMB和MacConKey分別為弱選擇性及選擇性分離培養基，S or—bitol Mac Con Key可作為鑒別培養基．因為阪崎腸桿菌有不分解山梨醇的特性。挑取菌落要選擇在SorbitolMacConKe上淡黃色或無(wú)色的菌落，在MacConKey瓊脂平板上呈淡粉色。阪崎腸桿菌EMB瓊脂平板上呈紫紅色黏液狀，不易在此平板上挑取單個(gè)菌落，只作為 輔助觀(guān)察。在Sorbitol MacConKey挑取的單個(gè)菌落連續接種4支 TSA斜面，便于觀(guān)察黃色 色素以及分別用于做氧化酶、觸酶、生化鑒定及G染色，留1支存放置2～8℃ 冰箱保存。這樣保證了所做的生化鑒定與保存的菌種來(lái)自于同1個(gè)菌落。  

美國疾病預防控制中心2002年從商業(yè)配方乳粉中分離到阪崎腸桿菌。當時(shí)使用基于Muytjens的方法：100g配方乳粉與400 mL，45℃磷緩沖蛋白胨水(BPW) 混合，36℃培養過(guò) 夜^［3］。本文采用這一步驟作為修復培養來(lái)提高檢測靈敏度。因為乳粉在生產(chǎn)過(guò)程中要經(jīng)過(guò)高溫噴霧干燥，致病菌易受到亞致死性損傷。比較結果表明：A和B兩組對嬰幼兒乳粉中阪崎腸桿菌均能起到修復的作用．B組修復培養靈敏度比A組高出1個(gè)稀釋度(10倍)。阪崎腸桿菌在5種分離培養基上都能生長(cháng)，其菌落顏色及特征符合該菌的生物學(xué)特征性反應。

3．3價(jià)格的比較

阪崎腸桿菌分離培養基使用價(jià)格的比較結果如表4所示 。     

3．4 出廠(chǎng)檢驗中的應用比較

熒光PCR試劑盒1900．0元( 48支／盒)：PCR試劑盒1800．0元(48支／盒)。API 20 E為1050．0元 (25支／套)，定性檢測，每件樣品做1管．分離培養僅挑取1個(gè)菌落鑒定計算，結果如表5所示 。

 

 

如果平均每天抽5批次，每批次樣品做1管，僅挑取1個(gè)菌落鑒定來(lái)計算．4 種方法1年所需金額比較結果如表6所示。 

 

注：*為使用Xa-GiaA分離培養基。

    鑒于目前國內外對阪崎腸桿菌檢測并無(wú)限定標準（標準值≤），國家規定嬰兒配方乳粉中是不得檢出阪崎腸桿菌。因此本文參照SN/T1632.1-2005中標準進(jìn)行定性檢測。傳統微生 物培養具有鑒定結果可靠的特點(diǎn)．能將阪崎腸桿菌鑒定至種．VRBGA 分離培養基鑒定結 果

需要7～8d．使用XaGiaA 分離培養基鑒定結果需要5～6d。選擇EMB．MacConKey，Sorb itolMacConKey這3種常用腸道分離培養基，且檢測費用低廉，方法便捷，檢測鑒定過(guò)程6d， 不需更多的設備．只需1臺36℃±1℃恒溫培養箱．便于乳品企業(yè)對每批次產(chǎn)品進(jìn)行阪崎腸

桿菌檢測．有效降低了企業(yè)及檢測機構檢測阪崎腸桿菌的成本。為執法部門(mén)的監管帶來(lái)更多的便利．有著(zhù)巨大的社會(huì )效益和經(jīng)濟效益。

PCR方法及熒光PCR方法可以快速有效地檢測目的基因，快速篩選。但是篩選陽(yáng)性還必須經(jīng)傳統微生物培養、生化鑒定，且檢測成本很高．企業(yè)檢驗人員操作有一定的難度。PCR和熒光PCR方法在分子生物學(xué)上特異性高．能在種的水平上進(jìn)一步鑒別菌株間同種不同型的差異，對阪崎腸桿菌各分離株之間進(jìn)行DNA序列同源性比較．有更大的意義。

作者：高建新，盧兆蕓， 肖菊珍， 吳越

作者單位：南 昌 市 疾 病 預 防 控 制 中 心

 

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