不同培養基對腸毒素大腸桿菌載體疫苗株免疫原性的影響

 

     摘要：分別采用固體CFA培養基和液體LB培養基培養，全菌ELISA，口服免疫Balb／c抗體測定，評價(jià)腸毒素大腸桿菌抗原CFA／I，CS6和載體志賀氏痢疾桿菌LtX5的免疫原性．結果表明：LB培養基培養不影響疫苗株抗原免疫原性．由此提示，LB培養基對腸毒素大腸桿菌載體疫苗生產(chǎn)是行之有效的．

    關(guān)鍵詞：腸毒素大腸桿菌；載體疫苗；培養基；免疫

 

腸毒素大腸桿菌(Enterotoxigenic  Escherichia  coli， ETEC) 是引起旅游者和發(fā)展中國家嬰幼兒腹瀉的主要致病菌^［1］．目前，疫苗的研制主要是針對定居因子菌毛和腸毒素而進(jìn)行的，包括滅活菌苗^［2］、亞單位疫苗^［3］ 、和載體疫苗^［4..5］等．

由于疫苗只有在CFA固體培養基上培養，ETEC菌毛才能有效地表達，因此，ETEC滅活苗的研制都是采用CFA固體培養基培養進(jìn)行生產(chǎn)的．筆者采用基因重組的手段，構建了以痢疾疫苗株為宿主的E T E C 載體疫苗．由于擔心液體培養可能會(huì )造成ETEC菌毛的嚴重脫落，所以一直采用固體培養．與固體培養相比，液體培養更為經(jīng)濟、方便，產(chǎn)生污染的機率更低， 更適于生產(chǎn)需求．因此，筆者曾嘗試以3種液體培養基，即CFA( 不添加瓊脂)，TS(T rypticase Soy broth)，LB(Luria  Berteani  broth)培養ETEC疫苗，結果發(fā)現菌毛抗原能夠在3種培養基中表達，且以L(fǎng)B培養基培養的效果最顯著(zhù)，而非CFA^［6］．本研究將進(jìn)一步比較固體CFA與液體LB之間的差別，評價(jià)液體培養與固體培養2種模式對疫苗的菌毛表達及免疫原性的影響水平，從而為ETEC疫苗的生產(chǎn)，尋找疫苗生長(cháng)和抗原表達的合適培養基提供依據． 

1． 1． 1  茵株  產(chǎn)生ETEC CFA／I，CS6菌毛抗原的疫苗候選株FWL01 (pZCF16)，志賀氏痢疾桿菌福氏2a疫苗T32的天冬氨酸一B一半醛脫氫酶(aspartateβ-semiaidehyde dehydro genase asd) 基因突變株FWL01^［7］．表達CFA／I野生ETEC菌E．coli44813，表達CS6野生 E T E C菌E  c o l i   5 1 9 ／ 6 6 A． 野生菌均購自 

中國藥品生物制品鑒定所．

1．1．2 培養基  CFA培養基(水解酪蛋白10g·L^-1 酵母粉115 g·L^-1，MgSO₄·7H₂ O 0．0 5 g·L ^-1，MnCI ₂ 0．005 g·L^-1，調pH至 7．4 )，普通液體LB培養基．

1．1．3 抗體  抗CFA／I單克隆抗體由瑞典Gobebourgs大學(xué)Svennerhom教授惠贈，CS6， LPS多克隆抗體

I．1．4 實(shí)驗動(dòng)物  6～8周齡雌性Balb／c小鼠，由軍事醫學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供，在 S P F動(dòng)物房飼養

 

1．2．1 細菌培養  LB培養基培養：將菌株過(guò)夜培養物，按1％的接種量接種于新LB液體培養基中，震蕩培養16 h．CFA培養基培養：同樣取菌株過(guò)夜培養物，以1 m L涂勻羅氏瓶， 倒置培養16 h． 培養溫度均為37℃．

1．2．2 全菌ELISA   按照文獻[8]進(jìn)行．

1．2．3 動(dòng)物免疫與抗體測定  按照文獻[5]進(jìn)行．

1．2．4 統計學(xué)方法  統計每組樣品的ELISA結果，進(jìn)行t檢驗分析^［9］．   

 

2．1   不同培養條件對疫苗候選株抗原表達水平的影響 疫苗候選株FWL01(pZCF16)是采用生物T程手段，分別將ETEC的2種重要的保護性抗原CFA／I和CS6基因克隆到載體疫苗株福氏2a  T32中，通過(guò)asd基因的宿主一質(zhì)粒平衡致死系統來(lái)保持質(zhì)粒，并穩定表達ETEC抗原．同野生ETEC相比，在此疫苗中，ETEC抗原不再受原ETEC表達系統的調控， 而是依賴(lài)外源啟動(dòng)子的作用進(jìn)行組成性表達．將收獲的培養物用PB調A 枷值為1，包被酶聯(lián)板，進(jìn)行全菌ELISA．2種培養方法的統計結果表明，P>0．05．說(shuō)明采用LB液體培養， 疫苗候選株生長(cháng)和抗原表達良好，CFA／I，CS6及宿主LPS (1ipopolysaccharide)菌達到了與 CFA培養基培養相一致的結果(見(jiàn)表1)．

 

 

2．2 不同培養條件對血清抗體IgG的影響  對2種不同方法新鮮培養的候選疫苗株，以相同菌量( 2 x 10⁸ ) 口服免疫各Balb／c小鼠組(每組5只)，2周免疫1次，共免疫3次，每次免疫前進(jìn)行眼底采血和新鮮糞便收集， 制備抗血清和糞便sI— g A，最后 1次免疫2周后采血．除CF A／I抗體IgG外，經(jīng)2種不同培養條件培養，ETEC抗原CS6和宿主菌抗原LIPS 2種特異性抗體IgG滴度完全一致．t檢驗結果P> 0．05，說(shuō)明對候選疫苗株各抗原的免疫原性沒(méi)有顯著(zhù)影響．

2．3   不同培養條件對糞便黏膜抗體slgA的影響  對制備糞便抗體進(jìn)行50倍稀釋?zhuān)瑴y定糞便抗CFA／I和CS6的sIgA抗體含量．數據顯示 (圖2)，LB液體培養疫苗候選株同CFA固體培養相比，激發(fā)機體產(chǎn)生的黏膜抗體sIgA含量稍低． 但 t  檢驗分析兩培養組產(chǎn)生的 s I g A抗體，P>0．05，此結果說(shuō)明，2種培養方法對候選疫苗株各抗原激發(fā)機體內的黏膜抗原抗體反應同樣有效．

最后一次采血后，處死Balb／c小鼠，取3 c m 小腸， 剪碎后加400μL 含0．05 mol· L^-1   EDTA的0．01 mol·L PBS懸浮，離心，收集上清液，制備腸液抗體slgA．對制備抗體進(jìn)行50倍稀釋?zhuān)瑴y定抗CFA／I和CS6的slgA抗體．數據顯示 (表2)，CFA／I，CS6，經(jīng)LB液體培養制備的免疫菌在Balb／csb鼠體內產(chǎn)生了較低的抗體低度．t檢驗結果為P >0．05，表明LB液體培養不影響ETEC抗原CFA／I和CS6的黏膜抗原抗體反應．

 

Samples were diluted at 1:50

 

ETEC流行病學(xué)研究結果表明：ETEC定居因子，即為菌體表面菌毛，與小腸黏膜黏附和腸毒素致毒是ETEC腹瀉不可或缺的2個(gè)必要條件．ETEC疫苗研究結果顯示：兩者同時(shí)又是激發(fā)機體產(chǎn)生有效免疫保護的主要抗原，是研制 E T E C疫苗最重要的2種組分．對于野生ETEC，ETEC菌毛的表達，需要Mg²⁺，Mn²⁺ 等離子，而且極易脫落．因此，為獲得ETEC菌毛的充分表達，傳統上一直沿用CFA固體培養基培養．不過(guò)，與固體培養相比， 液體培養一直是菌體培養的首選．

載體活菌疫苗是當前 E T E C疫苗研究中最為活躍的類(lèi)型之一． 特點(diǎn)是免疫接種后， 重組菌能夠在機體內繁殖， 產(chǎn)生保護性抗原， 并以載體菌為佐劑，持續激發(fā)機體產(chǎn)生特異性免疫性反應．對本研究構建的疫苗候選株FWL01(pZCF16)，ETEC抗原CFA／I和CS6表達不受原ETEC的調控限制．通過(guò)比較傳統固CFA和液體LB 2種培養基對疫苗候選株抗原表達與免疫原性的影響發(fā)現，常規LB培養基無(wú)論是菌毛表達和免疫Balb／c小鼠后產(chǎn)生的Ig G和黏膜sIgA抗體方面，都獲得了基本一致的實(shí)驗效果．同時(shí)，對載體菌抗原LPS的表達與免疫原性評價(jià)結果顯示，外源抗原表達不影響載體菌自身抗原的表達與免疫原性， 2種培養方法對載體菌自身的生長(cháng)和在機體中的免疫作用同樣有效． 該結果為本研究和開(kāi)發(fā)ETEC載體疫苗的大規模生產(chǎn)提供了依據．   

作者：鄭繼平^1a， 郭桂英 ^1b，韋雙雙^1a，周海龍^1a，張兆山 ²

作者單位：1．海南大學(xué)a．生命科學(xué)與農學(xué)院，b．教務(wù)處，

2．軍事醫學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所，《海 南 大 學(xué) 學(xué) 報 自 然 科 學(xué) 版 》