阪崎腸桿菌噬菌體的分離及其生物學(xué)特性（1）

摘要： 【目的】以阪崎腸桿菌模式菌株及分離菌株為指示菌，從污水中分離出該菌噬菌體，并對其基本生物學(xué)特性進(jìn)行研究�！痉椒ā恳噪p層瓊脂法從污水中分離噬菌體，通過(guò)同屬和同科參考菌株測定噬菌體的特異性和宿主譜；電鏡觀(guān)察噬菌體顆粒形態(tài)；隨機擴增多態(tài)性DNA ( RAPD ) 實(shí)驗分析噬菌體的分子生物學(xué)特性�！窘Y果】從污水中分離得到5株噬菌體，表現出較窄的宿主范圍，僅裂解阪崎腸桿菌，以ATCC51329分離的噬菌體SK2可裂婀 17株阪崎腸桿菌中的24株 (89％)，負染經(jīng)電鏡觀(guān)察，5株噬菌體都是由多面體頭部和尾部組成；隨機引物( 5^’一GAAACGGGTG一3^’ ) 擴增DNA分析，5株噬菌體DNA明顯不同：【結論】分離出的5株噬菌體僅對阪崎腸桿菌敏感，在阪崎腸桿菌的分型、預防、治療、以及生態(tài)環(huán)境的凈化等方面具有潛在用途。

關(guān)鍵詞：阪崎腸桿菌；噬菌體

中圖分類(lèi)號：X172   文獻標識碼：A   文章編號：0001—6209(2008)10- 1373-05 

 

近年來(lái)，阪崎腸桿菌( Enterobacter sakazakii) 通過(guò)嬰幼兒配方奶粉引起新生兒發(fā)病、導致死亡而受到廣泛關(guān)注…，2002同際食品微生物標準委員會(huì )將其定為威脅特殊人群生命或產(chǎn)生嚴重后遺癥的食源性病原菌。該菌1984年前被稱(chēng)為產(chǎn)黃色素的陰溝腸桿菌，之后重新劃分為腸桿菌屬的一個(gè)新種^［2］。目前已從工廠(chǎng)加工環(huán)境、食品原料及多種食品中分離出阪崎腸桿菌，為此，各國食品安全管理部門(mén)、生產(chǎn)嬰幼兒食品的企業(yè)對阪崎腸桿菌開(kāi)始控制，研究人員對其生物學(xué)特性、控制方法及溯源性方麗開(kāi)展研究。作為細菌病毒的噬菌體，以其嚴格的宿主特異性。應用于細菌的分型鑒定，并逐步在應對多重耐藥菌株、醫學(xué)治療和預防、食品加工衛生、建立新型畜牧和發(fā)酵工廠(chǎng)的消毒程序等方面開(kāi)發(fā)其應用價(jià)值，被認為是未來(lái)有效、安全的病原體治療和生態(tài)環(huán)境凈化生物制劑^［5］。

盡管噬菌體的研究歷史很長(cháng)，但對于阪崎腸桿菌噬菌體而言，直到2007年才第一次報道，也是目前查到的僅有的一篇文獻^［6］。本文以ATCC標準菌株和分離菌株為指示菌，從污水中分離得到對阪崎腸桿菌具有特異性的噬菌體，并對噬菌體、噬斑形態(tài)、宿主范圍、分子生物學(xué)特性等方面進(jìn)行了研究。

 

 

1 材料和方法

1．1 材料

1．1．1 菌株：阪崎腸桿菌：ATCC29544，ATCC 29004，ATCC 12868，ATCC 51329；陰溝腸桿菌( Enterobactercloacae ) ATCC 13047，產(chǎn)氣腸桿菌( Enterobacter aero—gene ) ATCC  13048，大腸埃希氏菌( Escherichia coli ) ATCC 11775。弗氏枸櫞酸桿菌( Citrobacter freundii) ATCC 8090，奇異變形桿菌(Proteus mirabilis) ATCC 10005，產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxyto ca ) ATCC 43165， 肺炎克雷伯氏菌( Klebsiella pneumoniae ) ATCC 4352，來(lái)自美國典型菌種

保藏中心 ( American TVpe Culture Collection，ATCC 。 其余27株阪崎腸桿菌IQCCl0403、IQCC10403． 1—10403． 26為本實(shí)驗室收集的從奶粉中分離菌株。ATCC 29544、ATCC

51329、ATCC29004，分離株10403.7和10403-14用于噬菌體的增值。

1．1．2 主要試劑和儀器：腦心浸液肉湯 (BHI)，difc公司；胰酪胨大豆胨瓊脂 (TSA)，營(yíng)養瓊脂，北京路橋技術(shù)有限公司。M-13DNA純化試劑盒，美國promega公司產(chǎn)品，隨機引物，購自上海博亞生物技術(shù)有限公司。擴增設備為GeneAmp PCR 9700PCR(ABI),美國應用生物系統公司出品

     參照文獻 ［6］的方法，取北京朝陽(yáng)市高碑店河水樣本，經(jīng)脫脂棉過(guò)濾除去雜質(zhì)，取100ml,加入1：100稀釋的阪崎腸桿菌普通營(yíng)養肉湯24h培養物6ml，37℃培養3-4h后觀(guān)察噬菌斑。取雙層平板上單個(gè)噬菌斑（透明、寬直徑）的瓊脂塊加入5ml營(yíng)養肉湯中，室溫放置1-2h后4℃過(guò)夜，次日取其0.1ml加入2ml肉湯培養基中，再加50μL相應宿主菌增菌液，混合后室溫放置15min,37℃培養過(guò)夜，培養液經(jīng)無(wú)菌濾器（0.22μm微孔濾膜）過(guò)濾，將濾液分裝4℃保存。濾液適當稀釋后，重復以上步驟至少3次，即得到純化的噬菌體。

1.3   噬菌體滴度測定

     將噬菌體原種用液體培養基作10倍連續稀釋后，每稀釋度取10μL,加入到0.2ml宿主菌增菌液中，在雙層平板測定噬斑滴度，滴度（pfu/mL）=密度適當的平板上的噬斑數×稀釋倍數×100^［7］，通過(guò)觀(guān)察形成噬菌斑的情況確定工作滴度（Routine test dilution,RTD）.

1.4 特異性與裂解譜實(shí)驗

將27株阪崎腸桿菌分離株和其他7種來(lái)自ATCC的腸桿菌科細菌參考菌株和分離菌株的工作菌株經(jīng)BHI增菌后，用無(wú)菌鑒沾取培養液涂布于營(yíng)養瓊脂，將10μL滴度為10⁶-10⁹pfu/mL的噬菌體滴在阪崎腸桿菌涂布區域，37℃培養18-24h,通過(guò)觀(guān)察菌苔上是否形成噬菌斑的宿主范圍。

1.5  噬菌體的電子顯微鏡觀(guān)察

挑去3-4個(gè)噬菌斑轉到約400μL，SM的緩沖液（5.8g NaCl,2.0g MgSO₄·7H₂O,50mL的1mol/L Tris(pH=7.5),0.1g明膠，于1L去離子水中，100kPa滅菌15min）,樣品在室溫下放置1h,然后滴到碳質(zhì)柵網(wǎng)上用乙酸雙氧軸進(jìn)行負燃，使用philips/Tecnai12透射電鏡觀(guān)察和拍照。

1.6        噬菌體分子生物學(xué)特性

按照使用說(shuō)明M-13DNA提取試劑盒提取噬菌體DNA。通過(guò)引物5^，-GAAACGGGTG-3^，對提取的噬菌體DNA進(jìn)行隨機擴增多態(tài)性（Randomamplified polymorphic DNA,RAPD）實(shí)驗分析，比較擴增片段的大小，初步得到分離噬菌體的分子生物學(xué)特性^［8］.50μL反應液中含25μL 2xPCR混合液（Promega），0.5μmol(2μL)引物，1μL分離DNA作為模板。22μL蒸餾水，循環(huán)條件：94℃ 5min,94℃ 1min,37℃ 1min,72℃ 2min，40個(gè)循環(huán)；72℃ 10min.通過(guò)2％瓊脂糖凝膠電泳檢查擴增產(chǎn)物。首先檢查RAPD-PCR選擇的10個(gè)堿基長(cháng)引物，在所有反應中設陰性對照，以確證擴增的可靠性。