豬鏈球菌2 型檢驗程序

一、 分離步驟和程序

 

　　1.可采集病人的血，腹水，腦脊液或者是尸檢標本;病、死豬的肝臟、脾臟、腹水、心血。4℃保存。

 

　　2.制作肝臟、脾臟的觸片，或用腹水、血液、腦脊液涂片，火焰固定后進(jìn)行革蘭氏染色，油鏡下觀(guān)是否有成對或短鏈狀革蘭氏陽(yáng)性球菌。

 

　　3.取有成對或短鏈狀革蘭氏陽(yáng)性球菌的標本接種選擇增菌培養液(含15 微克/毫升多粘菌素B，30 微克/毫升萘啶酮酸的腦心培養基)，或直接劃線(xiàn)接種含兩種抗生素的羊血瓊脂平板培養基，在蠟燭缸或CO2 培養箱中培養。

 

　　二、 血清學(xué)檢測

 

　　1.用蘭氏分型乳膠凝集鏈球菌試劑盒進(jìn)行分群

 

　　2.用豬鏈球菌1-34 個(gè)型血清進(jìn)行分型取一滴豬鏈球菌診斷血清懸滴于載玻片上，與一滴菌懸液充分混合，或用接種環(huán)(牙簽也可)刮取單個(gè)菌落直接與血清混合，觀(guān)察是否出現凝集反應，同時(shí)用生理鹽水做對照。

 

　　三、 生化反應

 

　　可用API 生化鑒定系統的api-strep 手工鑒定條進(jìn)行鑒定，該方法可直接鑒定到種。普通實(shí)驗室可以重點(diǎn)做VP , 七葉苷水解試驗，6.5%的氯化鈉生長(cháng)試驗，45 度﹑10 度生長(cháng)試驗，膽汁耐受(麥康凱培養基)。結果依次為陰性，陽(yáng)性，陰性，陰性，陰性，陰性，可初步認為豬鏈球菌�？伤徒坏接袟l件的單位做進(jìn)一步鑒定。 具有參考價(jià)值的生化反應項目有：

 

　　生長(cháng)特性

 

　　10℃ 45℃ 6.5%NaCl PH9.6 麥康凱培養基(膽汁耐受)

 

　　不生長(cháng) 不生長(cháng) 不生長(cháng) 不生長(cháng) 不生長(cháng)

 

　　發(fā)酵試驗

 

　　棉子糖 RAF 乳糖LAC 甘露糖MNS 山梨醇SOR 阿拉伯糖ARA 核糖RBS

 

　　+ + — — — —

 

　　葡糖INU 甘露醇MAN 丙酮酸 PRV 甘油Glycerol 松三糖melezitose 馬尿酸鹽hippurate

 

　　+ — — — — —

 

　　四、 基因鑒定，包括使用PCR 技術(shù)和對PCR 產(chǎn)物進(jìn)行序列分析

 

　　可挑取分純的菌落或在選擇平板上濕潤的可疑菌落，直接進(jìn)行PCR 檢測。

 

　　1、檢測豬鏈球菌種特異性16S rRNA。

 

　　上游引物：cagtatttaccgcatggtagatat 下游引物：gtaagataccgtcaagtgagaa

 

　　2、檢測豬鏈球菌莢膜多糖基因(cps2A)

 

　　上游引物：gttgagtccttatacacctgtt 下游引物：cagaaaattcatattgtccacc

 

　　3、檢測溶菌酶釋放相關(guān)蛋白編碼基因片段(mrp)

 

　　上游引物： ggtatacctt gctggtaccg ttc

 

　　下游引物：agtctctaca gctgtagctg g

 

　　4、PCR反應的條件：

 

　　94℃預變性5 分鐘;94℃、30 秒，60℃、30 秒，72℃、30 秒，25 個(gè)循環(huán)，最

 

　　后延伸72℃、5分鐘。取5 微升擴增產(chǎn)物在1.2℅的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳。