細胞培養培養基

基礎培養基

 

絕大多數培養基是建立在平衡鹽溶液(BSS)基礎上，添加了氨基酸、維生素和其它與血清中濃度相似的營(yíng)養物質(zhì)。最廣泛應用的培養基是Eearle`s MEM 的混合物，其中含有13種必須氨基酸、8種維生素。而Ham`s F12 也包括非必須氨基酸，維生素的范圍亦很廣，另外常規含有無(wú)機鹽和代謝添加劑(例如核苷酸)。MEM/F12 這兩種培養基各取1/2，形成神經(jīng)生物學(xué)最通用的培養基。Dulbecco`s改良培養基——DMEM，現應用于快速生長(cháng)的細胞，同MEM含有相同的營(yíng)養成分，但濃度高出2~4倍。選擇某種培養基，應仔細了解成分表，應知道大多數情形下培養基都有不足。例如，有些培養基在氨基酸中包括有谷氨酸，而這種培養基雖廣泛用于神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域，但它對某些對谷氨酸敏感的可能有細胞外毒性損傷的神經(jīng)元而言，則并非最佳選擇，特別是如果神經(jīng)元生長(cháng)在缺乏膠質(zhì)的環(huán)境中時(shí)。F12中含有硫酸亞鐵，據報道也有神經(jīng)毒效應。

 

在所有這些培養基中，谷氨酸比其他氨基酸有更高的濃度，這是因為它具有不穩定性以及在許多細胞培養中它常用作碳源。對于神經(jīng)元的培養常常在基礎培養基中增加葡萄糖的含量到0.6%或者加入丙酮酸(若培養基中這兩種物質(zhì)缺乏時(shí))。MEM與F12均要用5%的CO2來(lái)平衡，DMEM含更高濃度的NaCO3，要用10%的CO2來(lái)平衡，當然也可以在較低CO2濃度下使用。這些基礎培養基的組成成分是建立在對不同細胞系生長(cháng)的研究之上的，但通常在原代培養中使用也能有比較令人滿(mǎn)意的結果。

 

原則上，HEPES作為緩沖劑可用來(lái)代替碳酸氫鹽，以解除需要高濃度CO2培養環(huán)境的限制。實(shí)際操作中并非如此簡(jiǎn)單。顯然，溶解的CO2與碳酸氫鹽對良好的細胞生長(cháng)是重要的。Leiboviz`s L15培養基可用來(lái)在大氣環(huán)境中令神經(jīng)細胞生長(cháng)，該培養基采用了與眾不同的BSS作基礎，它含有高濃度的氨基酸來(lái)提高緩沖能力，培養基中使用半乳糖作碳源，以阻止培養基中乳酸形成，少量溶解的CO2由丙酮酸代謝產(chǎn)生。這一培養基的優(yōu)點(diǎn)是明顯的，特別是在保持較高CO2有困難時(shí)，例如在長(cháng)時(shí)間的顯微操作及生理學(xué)研究中。L15培養基已用來(lái)成功的培養了外周神經(jīng)元，但尚未在CNS神經(jīng)元的發(fā)育研究中全面檢測過(guò)。

 

血清

 

細胞在單純的基礎培養基中不能存活，在特殊類(lèi)型的細胞培養中必須提供某些痕量營(yíng)養物質(zhì)及生長(cháng)因子才能使細胞得以生長(cháng)并維持生長(cháng)狀態(tài)�；�礎培養基常常要添加血清，血清終濃度多為5~20%。特殊用途的血清來(lái)源須用經(jīng)驗確定，廣泛應用的血清種類(lèi)有馬血清與胎牛血清。胎牛血清中富含有絲分裂因子，常選其作增殖細胞用的血清，也用于細胞系和原代培養。而馬血清常常用來(lái)作有絲分裂后的神經(jīng)元培養。然而，很多人也將胎牛血清用于神經(jīng)元培養，也有人用馬血清來(lái)培養膠質(zhì)細胞。用大鼠進(jìn)行神經(jīng)元培養的某些研究者喜歡使用同型血清;人類(lèi)的胎盤(pán)血清，亦曾用于神經(jīng)組織的器官類(lèi)型的培養，也用在一些特殊培養種類(lèi)中。

 

血清的不同批號含有不同的成分，所以許多人發(fā)現，應該在使用前對血清進(jìn)行測試。大多數試劑商提供樣品，所滿(mǎn)意的批號即可選用，這樣可以一次得到足夠一年用量的血清，血清在使用前通常在56℃加熱30分鐘，這一過(guò)程稱(chēng)為滅活。

 

無(wú)血清培養基

 

1979年神經(jīng)細胞培養出現了一個(gè)重要進(jìn)展，用化學(xué)添加劑即可維持神經(jīng)細胞存活與生長(cháng)而不需要在培養基中添加血清。其工作基礎是用合適的激素、營(yíng)養物和促貼壁的物質(zhì)的組合置換培養基中的成分，最后找到了適合大多數細胞培養的試劑配方，該配方稱(chēng)為N2，專(zhuān)門(mén)用于神經(jīng)細胞培養，最早是用在B104大鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞系的培養。它的基礎培養基是1：1的DMEM與H12的混合液，添加了胰島素、轉鐵蛋白、黃體酮、腐胺和硒。胰島素和胰島素樣生長(cháng)因子對于大多數類(lèi)型細胞的存活和生長(cháng)有重要作用，硒是谷胱甘肽產(chǎn)生的合作因子，可能有助于過(guò)氧化物和超氧化物的水解，有報道說(shuō)還能防止細胞的光照損傷。隨后的其他配方如N1N3則含有較低濃度的轉鐵蛋白。

 

未料到的是上述配方構成的培養基可以支持神經(jīng)母細胞瘤細胞系快速增殖，隨后又發(fā)展了能支持原代培養的各種神經(jīng)元生長(cháng)的培養基，這種培養基在許多實(shí)驗室里已取代了有血清培養。在某些培養方案中，細胞直接進(jìn)入無(wú)血清培養，這樣的培養基可以消除來(lái)自血清的不均一性。更為重要的是，它們可用來(lái)檢測生長(cháng)因子以及其他促進(jìn)神經(jīng)元存活或生長(cháng)的因子，或者用來(lái)檢測那些可保護神經(jīng)元免遭環(huán)境毒物損傷的制劑。專(zhuān)用于神經(jīng)元的培養基在某些培養環(huán)境中還可以減低非神經(jīng)元細胞的增殖，故可使神經(jīng)元純化。

 

血清中含有的組分，例如血清蛋白，可作為代謝毒物清除劑使用并能聚集于培養基中。當缺乏這些成分時(shí)，如神經(jīng)元在無(wú)血清培養基中生長(cháng)時(shí)，特別容易為過(guò)氧化物及自由基傷害，這已被許多研究者注意到了。過(guò)氧化物酶以及超氧化物歧化酶可阻止培養基中過(guò)氧化物和超氧化物的累積，有報道講可以促進(jìn)低密度培養細胞的存活。有學(xué)者發(fā)現細胞存活可為氧分壓的下降而促進(jìn)。因而，無(wú)血清培養基的配方常含有抗氧化劑的試劑。例如，維生素E和丙酮酸，可作為過(guò)氧化物清除劑使用。上述這些影響在高密度培養時(shí)變小，特別是神經(jīng)元與膠質(zhì)共培養時(shí)，它們可以吸收和代謝神經(jīng)元毒性物質(zhì)如谷氨酸。

 

應該注意，盡管無(wú)血清培養基是有化學(xué)限定性的，但在培養過(guò)程中它仍有變動(dòng)，培養起始時(shí)可能有些物質(zhì)缺乏，而后細胞的產(chǎn)物可能積累，從而使培養基的成分改變。這其實(shí)是有另一方面的好處，即條件培養基(已培養過(guò)細胞的培養基)的形成，條件培養基常常用來(lái)增加神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞的發(fā)育。

 

生長(cháng)因子絕大多數哺乳類(lèi)胚胎神經(jīng)元有嚴格的營(yíng)養要求，若不能提供適宜的生長(cháng)因子或合適的因子組分，將會(huì )使絕大多數神經(jīng)元在體外培養的數天中死亡。解決這一問(wèn)題有兩條思路，一是讓培養細胞提供自己的營(yíng)養因子，二是在培養基中加入純的生長(cháng)因子。如果細胞混合物能在高密度時(shí)生長(cháng)，所需的生長(cháng)因子便會(huì )積累到可觀(guān)的數值，尤其當培養基很少變化時(shí)。若某種細胞混合物生長(cháng)時(shí)有很少的營(yíng)養需求，可保持培養基在一段時(shí)間里不作任何變動(dòng)，以使營(yíng)養(生長(cháng))因子積累，而最后促使所需要的細胞類(lèi)型能夠生長(cháng)。但是，這種對營(yíng)養(生長(cháng))因子自身倚賴(lài)性亦有弊端，因為通常在混合細胞群體中細胞很難有同比例增殖，某些細胞會(huì )因生長(cháng)條件的貧乏而受限制。另外，這種方法只能進(jìn)行相當高密度的細胞培養。因為培養基的條件在細胞的較低密度時(shí)變的不夠有效。不過(guò)某些時(shí)候純化神經(jīng)元群體的低密度培養可用條件培養基(經(jīng)過(guò)了高密度培養)進(jìn)行，或在膠質(zhì)上生長(cháng)的神經(jīng)元所用過(guò)的培養基來(lái)支持。

 

滿(mǎn)足神經(jīng)元營(yíng)養需求的第二條途徑是向培養基中加入生長(cháng)因子。通常用于組培的通用適宜因子是神經(jīng)生長(cháng)因子NGF。不過(guò)，只有少數對這種蛋白質(zhì)有反應的細胞類(lèi)型的細胞才能生長(cháng)。

 

許多PNS類(lèi)型的神經(jīng)元在離體狀態(tài)時(shí)表現出簡(jiǎn)單的營(yíng)養需求，只需提供單一的營(yíng)養因子就足以使其在低密度時(shí)增殖。例如，大鼠交感神經(jīng)元僅需NGF即能存活，在其生存期間，這些神經(jīng)元可在嚴格局限條件下生長(cháng)好幾個(gè)月(即在無(wú)血清培養基中、或缺乏膠質(zhì)細胞、或在化學(xué)限定基質(zhì)上)。有證據表明NGF是活體中交感神經(jīng)元存活的生理調節因子。然而，交感神經(jīng)元也對來(lái)自膠質(zhì)細胞的神經(jīng)營(yíng)養因子(GDNF)有反應，還有NT3、LIF與CNTF也對其有作用。在不產(chǎn)生GDNF或NT3的動(dòng)物中，交感神經(jīng)元會(huì )有損傷。在離體與活體營(yíng)養需求之間的差別或許可以用在不同環(huán)境中NGF含量和分布的不同來(lái)解釋?zhuān)�培養中的NGF彌散在整個(gè)環(huán)境中，而在活體內，大部分區域的含量是有限的。因此，NGF的重要性在于其合適的濃度。盡管在大多數實(shí)驗中已經(jīng)習慣了營(yíng)養因子的最大效應使用量，其他營(yíng)養因子的協(xié)同效應在亞優(yōu)劑量下更容易觀(guān)察到。此外，高濃度的營(yíng)養因子可使細胞更能抵抗毒劑以及其他壓力。相應的，低濃度的營(yíng)養因子可能用來(lái)檢查表現型，例如對自由基或氨基酸的毒性刺激劑量的反應。有許多其他的PNS培養系統只需單一營(yíng)養因子就可使有實(shí)用價(jià)值的細胞保持在一定比例，廣為人知的有雛雞睫狀自主神經(jīng)節神經(jīng)元和大鼠背根神經(jīng)節感覺(jué)神經(jīng)元。不過(guò)，這些模型也有局限性。例如，培養中的睫狀神經(jīng)節的神經(jīng)元加入CNTF時(shí)，超過(guò)90%的神經(jīng)元能存活一個(gè)很長(cháng)時(shí)期，但并未有跡象表明它屬于內源的靶細胞來(lái)源的營(yíng)養因子，而是有爭論的相關(guān)分子，GPA，扮演了這一角色。大鼠背根神經(jīng)節含有好幾種細胞群體，其中小細胞群、包括nocioceptive cell，對NGF有反應，但其他神經(jīng)元，例如大細胞群中的proprioception 卻對不同的神經(jīng)營(yíng)養因子有反應。因此，在大多條件下培養物的生長(cháng)并不能忠實(shí)反映親代群體的所有特性，這一問(wèn)題在CNS的細胞培養中特別突出，因為已有的經(jīng)驗表明，沒(méi)有一種培養基能適合于所有類(lèi)型及亞類(lèi)的神經(jīng)細胞的生長(cháng)。

 

現有的證據已表明，CNS神經(jīng)元的營(yíng)養需求比PNS的更復雜。對脊髓運動(dòng)神經(jīng)元與視網(wǎng)膜節細胞神經(jīng)元的研究表明，這些神經(jīng)元與外周神經(jīng)元相比能對更為廣泛的營(yíng)養因子起反應。例如，至少發(fā)現了15種不同的分子可在離體條件下增加神經(jīng)元的存活。而且，已觀(guān)察到運動(dòng)神經(jīng)元與視網(wǎng)膜對任何單獨的營(yíng)養因子的存活反應，與PNS中所觀(guān)察到的典型反應相比，都要小得多。因此，大多數影響運動(dòng)神經(jīng)元及視網(wǎng)膜節細胞的營(yíng)養因子僅僅只能支持神經(jīng)元的亞群，而神經(jīng)元的最佳存活要求諸多因子的結合。在視網(wǎng)膜節細胞的培養中，因子的最佳組合(如BDNF、CNTF、IGF、bFGF)包括了來(lái)自不同生長(cháng)因子家族的代表。這一結果的普遍性尚待進(jìn)一步的證實(shí)，但敲除單一的營(yíng)養因子基因之后，沒(méi)有表現出對CNS大多類(lèi)群的神經(jīng)元的存活產(chǎn)生太大影響，這一觀(guān)察與上述的事實(shí)是一致的�，F已知少突膠質(zhì)細胞的長(cháng)期存活也需要眾多營(yíng)養因子的相互作用。

 

抗生素

 

在細胞培養中最常用的抗生素是青霉素(常用濃度是25~100ui/ml)與鏈霉素(25~100μg/ml)。這兩種抗生素�；旌鲜褂�。在一些實(shí)驗室里，它們常規加入所有的培養基中。慶大霉素(10~100μg/ml)通常有廣譜抗菌效應，并具有溶液穩定性，故也被一些實(shí)驗室使用，特別是當有低水平的污染存在時(shí)更是這樣。以上這些試劑對霉菌與酵母菌的污染均無(wú)效。

 

盡管很多實(shí)驗室在細胞系的培養基中常規加入抗生素作繼代培養，但仍建議不要在原代培養中加入抗生素，其理由之一是獲得的細胞是無(wú)菌的，原代培養時(shí)的細菌污染很少發(fā)生。其次，盡管認為抗生素對細胞代謝的影響可忽略，但最好避免使用它們，以免細胞生長(cháng)環(huán)境的不穩定。最重要的是要意識到培養中主要污染物的類(lèi)型，它們通常暗示了問(wèn)題的來(lái)源。

 

抗有絲分裂劑

 

某些DNA合成抑制劑對分裂細胞有毒，但對沒(méi)有DNA合成的細胞僅有輕微影響。由于神經(jīng)元通常缺乏DNA合成能力，因此對抗有絲分裂劑沒(méi)有多大反應。這樣的試劑常常用于神經(jīng)元的培養，以消除或減少非神經(jīng)元群體。若要殺死所有的非神經(jīng)元細胞，可以先加入血清或生長(cháng)因子來(lái)保證有高比例的非神經(jīng)元細胞進(jìn)行DNA合成，此時(shí)再加入抗有絲分裂劑。但是，某些細胞在它的細胞周期的某些時(shí)相時(shí)對抗有絲分裂劑是不敏感的。不過(guò)，可以重復的將抗有絲分裂劑使用于增殖的細胞群體。在CNS神經(jīng)元的培養中抗有絲分裂劑常常在星形細胞形成單層后加入，此時(shí)，星形細胞由于接觸抑制而終止了DNA的合成(即細胞停止增殖)，它們不會(huì )因抗有絲分裂劑的加入而死亡。原代培養中用這種方法阻止成纖維細胞的過(guò)度增殖是十分必要的。有兩種抗有絲分裂劑常用于神經(jīng)元的培養：Fluorodexyuridine，是胸苷合成酶抑制劑，一般使用濃度為～10μM。尿苷(10μM)也常使用，可阻止不分裂細胞的RNA合成。另外，阿糖胞苷也常被使用，其使用濃度為5～50μM。使用任何一種抗有絲分裂劑，都必須考慮它的神經(jīng)原毒性，應該確定最低效應的使用濃度。阿糖胞苷在很低的濃度下，也會(huì )對某些種類(lèi)的神經(jīng)元有毒性，可以造成特定神經(jīng)原的死亡。其他的抗有絲分裂劑尚未表現出這種毒性。

 

培養的保持

 

培養物是應該保持在孵箱中的。孵箱可以自動(dòng)將O2與CO2混合很快達到培養基的設計要求，空氣中的氧濃度比血液和腦脊液中要高得多。對于某些細胞的生長(cháng)，包括神經(jīng)原，應使氧含量處在一個(gè)較低的水平�？梢杂梅跸溥_到這個(gè)標準，但這樣的孵箱并未廣泛使用。

 

高濕度可避免培養皿中培養基的蒸發(fā)，保持孵箱中的濕度通常是在箱底部放上一大盆水，這水應該經(jīng)常換，乘水容器應經(jīng)常消毒以防霉菌生長(cháng)。若孵箱曾被霉菌孢子嚴重污染過(guò)，那么要想完全去除污染則會(huì )非常困難。當培養物必須要長(cháng)期保持在孵箱中時(shí)，應采用較少培養基的瓶、皿，且將蓋子蓋緊以避免蒸發(fā)，或采用相應的按比例供空氣的孵箱。

 

溫度的精確調節應定期檢查，孵箱溫度常設置為37℃或較低溫度。細胞在低溫時(shí)可有較長(cháng)時(shí)間的忍耐限度，但當溫度升至39℃時(shí)，幾小時(shí)內即死亡。

 

維持培養物的最佳方案常常改變。例如培養膠質(zhì)細胞時(shí)，要經(jīng)常換液以使其增殖達到最大。而在培養某些神經(jīng)原時(shí)，則要求盡可能少的換液，神經(jīng)原在兩次換液之間的條件下長(cháng)的最好。大腦皮質(zhì)的培養要求在不換液的情形下維持一個(gè)月以上。另一方面，象海馬神經(jīng)原那樣的細胞，倚賴(lài)于條件培養基，若換液太頻繁細胞就會(huì )衰退，此時(shí)，可采用1/3或1/2換液的方式。