濾膜法測定總大腸菌群

1 主題內容與適用范圍

    本方法規定了生活飲用水中總大腸菌群的濾膜測定方法。

    本方法適用于生活飲用水和低濁度的水源水中總大腸菌群數的測定。

    2 方法提要

    用孔徑為0.45μm的微孔濾膜過(guò)濾水樣，細菌被截留在濾膜上，將濾膜貼在選擇性培養基上，經(jīng)培養后，計數生長(cháng)在濾膜上的典型大腸菌群菌落數。

    3 培養基與試劑

    3.1 品紅亞硫酸鈉培養基

    3.1.1 成份

    A 蛋白胨 10g

    B 酵母浸膏 5g

    C 牛肉膏 5g

    D 乳糖 10g

    E 瓊脂 15~20g

    F 硫酸氫二鉀 3.5g

    G 無(wú)水亞硫酸鈉 5g左右

    H 堿性品紅乙醇溶液(50g/L) 20mL

    I 蒸餾水 1000mL

    3.1.2 儲存培養基的制備

    先將瓊脂加到500mL蒸餾水中，煮沸溶解，于另500mL蒸餾水中加入硫酸氫二鉀、蛋白胨、酵母浸膏和牛肉膏，加熱溶解，倒入已溶解的瓊脂，補充蒸餾水至1000mL，混勻后調pH為7.2~7.4，再加入乳糖，分裝，115℃高壓滅菌20min，儲存于冷暗處備用。

    3.1.3 平皿培養基的配制

    將上法制備的儲存培養基加熱融化，用滅菌吸管按比例吸取一定量的5％堿性品紅乙醇溶液置于滅菌空試管中，再按比例稱(chēng)取所需的無(wú)水硫酸鈉置于另一滅菌試管中，加滅菌水少許，使其溶解后，置沸水浴中煮沸10min以滅菌。

    用滅菌吸管吸取已滅菌的亞硫酸鈉溶液，滴加于堿性品紅乙醇溶液至深紅色退成淡粉色為止，將此亞硫酸鈉與堿性品紅的混合液全部加到已融化的儲存培養基內，并充分混勻(防止產(chǎn)生氣泡)，立即將此種培養基15mL傾入已滅菌的空平皿中。待冷卻凝固后置冰箱內備用。此種以制成的培養基于冰箱內保存不宜超過(guò)二周。如培養基已由淡粉色變?yōu)樯罴t色，則不能再用。

    3.2 乳糖蛋白胨培養基

    3.2.1 成份

    A 蛋白胨 10g

    B 牛肉膏 3g

    C 乳糖 5g

    D 氯化鈉 5g

    E 溴甲酚紫乙醇溶液(16g/L) 1mL

    F 蒸餾水 1000mL

    3.2.2 制法

    將蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化鈉溶于蒸餾水中，調整pH為7.2~7.4，再加入1mL1.6％溴甲酚紫乙醇溶液，充分混勻，分裝于裝有倒管的試管中，115℃高壓滅菌20min，貯存于冷暗處備用。

    4 儀器

    4.1 濾器。

    4.2 濾膜，孔徑0.45~0.65μm。直經(jīng)根據濾器規格，目前常用的有3.5cm和4.7cm兩種。

    4.3 抽濾設備。

    4.4 無(wú)齒鑷子。

    4.5 培養箱: 36±1℃。

    4.6 冰箱: 0~4℃。

    4.7 天平。

    4.8 顯微鏡。

    4.9 平皿: 直徑為9cm。

    4.10 滅菌刻度吸管: 1mL,10mL。

    5 檢驗步驟

    5.1 準備工作

    5.1.1 濾膜滅菌:

    將濾膜放入燒杯中，加入蒸餾水，置于沸水浴中煮沸滅菌三次，每次15min。前兩次煮沸后需更換水洗滌2~3次，以除去殘留溶劑。

    5.1.2 濾器滅菌: 用點(diǎn)燃的酒精棉球，火焰滅菌。也可用121℃高壓滅菌20min。

    5.2 過(guò)濾水樣

    用無(wú)菌鑷子夾取滅菌濾膜邊緣部分，將粗糙面向上，帖放在已滅菌的濾床上、，固定好濾器，將100mL水浴(如水樣含菌數較多，可減少過(guò)濾水樣量，或將水樣稀釋)注入濾器中，打開(kāi)濾器閥門(mén)，在負0.5大氣壓下抽濾。

    5.3 培養

    水樣濾完后，再抽氣約5s，關(guān)上濾器閥門(mén)，取下濾器，用滅菌鑷子夾取濾膜邊緣部分，移放在品紅亞硫酸鈉培養基(36.1.3.1)上，濾膜截留細菌面向上，濾膜應與培養基完全貼緊，兩者間不得留有氣泡，然后將平皿倒置，放入37℃恒溫箱內培養22~24h。

    6 觀(guān)察結果

    6.1 挑出符合下列特征菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢。

    紫紅色，具有金屬光澤的菌落。

    深紅色，不帶或略帶金屬光澤的菌落。

    淡紅色，中心色較深的菌落。

    6.1.1凡革蘭氏染色為陰性的無(wú)芽胞桿菌，再接種乳糖蛋白胨培養基液，于37℃培養24h，有產(chǎn)酸產(chǎn)氣者，則判定為總大腸菌群陽(yáng)性。

    6.1.2 計算濾膜上生長(cháng)的總大腸菌群數，以每100mL

                                                  

    總大腸菌群菌落數(CFU/100mL)＝水樣中的總大腸菌群數報告之(CFU/100mL)/ 過(guò)濾的水樣體積(mL)