家庭組織培養建議——操作

  清洗干凈的容器要注意防塵，盡量放置在玻璃柜中。更簡(jiǎn)單的是用干凈的毛巾將容器蓋住。

  移液管要用吸球來(lái)清洗，反復用蒸餾水吹吸直到潔凈為止，將移液管放置在一個(gè)長(cháng)筒中，便于使用。一般移液管只能使用一次，即要清洗，所以有多必要準備幾只移液管，建議：10ml/2支，5ml/2支，1ml/5支。

  2.培養基的配制：

  經(jīng)典的組織培養用培養基是ms配方，其基本上劃分為：大量元素、微量元素、鐵鹽、有機復合物、植物激素、糖和支持物。這些成分的用量都在毫克級，用普通天平是難以稱(chēng)量的，為了解決這個(gè)問(wèn)題，我們可以按比例放大各成分的用量配制成母液，使用的時(shí)候按一定比例加入即可。

  下面將一種ms培養基的母液配制方案公布如下：

  大量元素：硝酸銨66.0克；

  硝酸鉀76.0克；

  無(wú)水氯化鈣13.3克；

  七水硫酸鎂14.8克；

  磷酸二氫鉀6.8克。

  以上分別溶解后合并定容到1升，每配制1升標準ms培養基取25毫升。

  鐵鹽：七水硫酸亞鐵5.56克；

  乙二胺四乙酸二鈉（edtana）7.46克。

  以上兩種分別加熱溶解，混合，定容到1升，調整ph到5.5以下，每配制一升ms取5毫升。

  微量元素和有機復合物的用量過(guò)于微小，為了簡(jiǎn)便我們可以用蔬菜提取液或者馬鈴薯提取液代替。通常我們習慣用100克菠菜加100ml的水煮沸10分鐘，過(guò)濾留濾液，每配制1升ms培養基加入20~50毫升提取液。同樣也可以使用帶皮馬鈴薯100克加200毫升水煮沸15分鐘，過(guò)濾留濾液，每升ms加入50~100毫升即可。

  加入上述各組分后，每升ms培養基還需要加入白砂糖30克，瓊脂7克。

  這里要說(shuō)明的是，糖和瓊脂都是可變的量，要根據需要調整。另外制作果凍用的卡拉膠也可以代替瓊脂，透明度更好。

  上述各成分加入后，定容到800毫升左右，用微波爐加熱，直到瓊脂全部溶解為止。此時(shí)加入所需的植物激素（通常配制成0.1%溶液，這樣每取1毫升，換算到培養基中就是1ppm）。然后加水定容到1100毫升（1.1升），之所以多出0.1升是為了抵消分裝和消毒中的損耗。最后用酸堿調整ph到5.8~6.0。

3.使用ms原粉配制培養基：

  目前國內的一些化學(xué)品公司開(kāi)發(fā)了簡(jiǎn)便的ms培養基原粉，大大簡(jiǎn)便了培養基的配制，根據不同公司的說(shuō)明選擇培養基的種類(lèi)。下面就以ms原粉為例： ms培養基原粉，包括了大量元素、微量元素、鐵鹽、有機復合物、糖和瓊脂，一般按使用方法稱(chēng)量，微波爐加熱溶解，加入激素，定容到1100毫升（1.1升），調整ph值到5.8~6.0。 

 4.分裝：

  將配制好的培養基分裝在培養容器中，注意要趁熱分裝，因為瓊脂在40度以下就會(huì )凝固。每個(gè)培養瓶裝培養基大約是瓶容積的1/6~1/5，注意不要將培養基掛在瓶的外壁，這樣容易造成污染。分裝后用聚丙烯薄膜或著(zhù)方便面的袋子封口，用膠圈固定（膠圈盡量選擇自行車(chē)的內胎，這種膠圈比較耐熱）。

 5. 滅菌：

  采用家庭壓力鍋消毒，建議到醫療器械用品商店買(mǎi)一些“滅菌效果試紙”，它們可以指示滅菌效果，當滅菌達到效果時(shí)會(huì )變色。把試紙和培養基同時(shí)放入鍋內，加熱到有大量蒸汽冒出，再加上壓力伐，維持小火30~40分鐘。

    滅菌完畢后自然冷卻，將培養基取出，放在陰涼無(wú)塵處備用。

 6. 接種箱的準備：

  新制作的接種箱必須要清潔干凈，盡量做到無(wú)死角。每次使用前2小時(shí)，將操作所需要的全部物品放入接種箱，再用一個(gè)小燒杯加入3~5克高錳酸鉀放入接種箱內，在箱內向燒杯中倒入2~3毫升的甲醛溶液，大約幾秒鐘后會(huì )看到甲醛蒸汽出現，這樣可以對接種箱內的所有物品進(jìn)行初次消毒；同時(shí)打開(kāi)紫外線(xiàn)燈照射。紫外線(xiàn)燈是高電壓穿激汞蒸汽產(chǎn)生的，紫外線(xiàn)進(jìn)行第二道滅菌，在紫外線(xiàn)照射大約15分鐘后，會(huì )激發(fā)氧氣形成臭氧，臭氧作為第三道滅菌防線(xiàn)，這樣經(jīng)過(guò)三次滅菌，接種箱基本上可以達到無(wú)菌標準。

  在操作前15分鐘內，向剛才蒸發(fā)甲醛用的燒杯中倒入5毫升濃氨水，因為甲醛對人體有毒害作用，氨水可以和甲醛形成一種叫做“六亞甲基四胺”的固體物質(zhì)，從而中和了甲醛的刺激性蒸汽。這個(gè)時(shí)候紫外燈不要關(guān)掉，要繼續照射，直到操作前5分鐘關(guān)閉，維持黑暗5分鐘，然后再打開(kāi)日光燈進(jìn)行操作。維持5分鐘黑暗的原因是，紫外光對微生物的殺滅是作用于dna的胸腺嘧啶，形成四聚體，但是微生物具有一種光復活蛋白，可以在有可見(jiàn)光的環(huán)境下還原胸腺四聚體，而使微生物復活，這個(gè)作用叫做“光復活作用”，所以在關(guān)掉紫外燈后必須維持黑暗幾分鐘，避免光復活作用的出現。