實(shí)驗——培養基的配制與滅菌

1 目的

1.1了解并掌握培養基的配制、分裝方法

1.2掌握各種實(shí)驗室滅菌方法及技術(shù)。

2 原理

培養基是供微生物生長(cháng)、繁殖、代謝的混合養料。由于微生物具有不同的營(yíng)養類(lèi)型，對營(yíng)養物質(zhì)的要求也各不相同，加之實(shí)驗和研究的目的不同，所以培養基的種類(lèi)很多，使用的原料也各有差異，但從營(yíng)養角度分析，培養基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、無(wú)機鹽、生長(cháng)素以及水分等。另外，培養基還應具有適宜的pH值、一定的緩沖能力、一定的氧化還原電位及合適的滲透壓。

瓊脂是從石花菜等海藻中提取的膠體物質(zhì)，是應用最廣的凝固劑。加瓊脂制成的培養基在98～100℃下融化，于45℃以下凝固。但多次反復融化，其凝固性降低。

任何一種培養基一經(jīng)制成就應及時(shí)徹底滅菌，以備純培養用。一般培養基的滅菌采用高壓蒸汽滅菌。

3 材料

3.1器皿及材料

天平、稱(chēng)量紙、牛角匙、精密pH試紙、量筒、刻度搪瓷杯、試管、三角瓶、漏斗、分裝架、移液管及移液管筒、培養皿及培養皿盒、玻璃棒、燒杯、試管架、鐵絲筐、剪刀、酒精燈、棉花、線(xiàn)繩、牛皮紙或報紙、紗布、乳膠管、電爐、滅菌鍋、干燥箱。

3.2藥品試劑 

蛋白胨、牛肉膏、NaCl、K2HPO4、瓊脂、NaNO3、KCl、MgSO4、FeSO4、蔗糖、麥芽糖、木糖、葡萄糖、半乳糖、乳糖、土豆汁、豆芽計、磷酸銨、5%NaOH溶液、5%HCl溶液。

4 流程

稱(chēng)藥品→溶解→調pH值→融化瓊脂→過(guò)濾分裝→包扎標記→滅菌→擺斜面或倒平板。

5 步驟

5.1  培養基的制備

5.1.1  稱(chēng)量藥品

根據培養基配方依次準確稱(chēng)取各種藥品，放入適當大小的燒杯中，瓊脂不要加入。蛋白胨極易吸潮，故稱(chēng)量時(shí)要迅速。

5.1.2  溶解

用量筒取一定量(約占總量的1/2)蒸餾水倒入燒杯中，在放有石棉網(wǎng)的電爐上小火加熱，并用玻棒攪拌，以防液體溢出。待各種藥品完全溶解后，停止加熱，補足水分。如果配方中有淀粉，則先將淀粉用少量冷水調成糊狀，并在火上加熱攪拌，然后加足水分及其它原料，待完全溶化后，補足水分。

5.1.3  調節pH

根據培養基對pH的要求，用5%NaOH或5%HC1溶液調至所需pH。測定pH可用pH試紙或酸度計等。

5.1.4  溶化瓊脂

固體或半固體培養基須加入一定量瓊脂。瓊脂加入后，置電爐上一面攪拌一面加熱，直至瓊脂完全融化后才能停止攪拌，并補足水分(水需預熱)。注意控制火力不要使培養基溢出或燒焦。

5.1.5  過(guò)濾分裝

先將過(guò)濾裝置安裝好。如果是液體培養基，玻璃漏斗中放一層濾紙，如果是固體或半固體培養基，則需在漏斗中放多層紗布，或兩層紗布夾一層薄薄的脫脂棉趁熱進(jìn)行過(guò)濾。過(guò)濾后立即進(jìn)行分裝。分裝時(shí)注意不要使培養基沾染在管口或瓶口，以免浸濕棉塞，

     引起污染。液體分裝高度以試管高度的1/4左右為宜。固體分裝裝量為管高的1/5，半固體分裝試管一般以試管高度的1/3為宜；分裝三角瓶，其裝量以不超過(guò)三角瓶容積的一半為宜。

5.1.6  包扎標記

培養基分裝后加好棉塞或試管帽，再包上一層防潮紙，用棉繩系好。在包裝紙上標明培養基名稱(chēng)，制備組別和姓名、日期等。

5.1.7  滅菌

上述培養基應按培養基配方中規定的條件及時(shí)進(jìn)行滅菌。普通培養基為121℃20min，以保證滅菌效果和不損傷培養基的有效成份。培養基經(jīng)滅菌后，如需要作斜面固體培養基，則滅菌后立即擺放成斜面(圖3-2)，斜面長(cháng)度一般以不超過(guò)試管長(cháng)度的1/2為宜；半固體培養基滅菌后，垂直冷凝成半固體深層瓊脂。

5.1.8  倒平板

將需倒平板的培養基，于水浴鍋中冷卻到45～50℃,立刻倒平板（圖3-3）。

5.2  滅菌方法

    滅菌是指殺死或消滅一定環(huán)境中的所有微生物，滅菌的方法分物理和化學(xué)滅菌法兩大類(lèi)。本實(shí)驗主要介紹物理方法的一種，即加熱滅菌。

加熱滅菌包括濕熱和干熱滅菌兩種。通過(guò)加熱使菌體內 蛋白質(zhì)凝固變性，從而達到殺菌目的。蛋白質(zhì)的凝固變性與其自身含水量有關(guān)，含水量越高，其凝固所需要的溫度越低。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，因為在濕熱情況下，菌體吸收水分，使蛋白質(zhì)易于凝固；同時(shí)濕熱的穿透力強，可增加滅菌效力。

 

5.2.1  濕熱滅菌

5.2.1.1  煮沸消毒法

注射器和解剖器械等均可采用此法。先將注射器等用紗布包好，然后放進(jìn)煮沸消毒器內加水煮沸。對于細菌的營(yíng)養體煮沸約15～30min，對于芽孢則需煮沸約1～2h。

5.2.1.2  高壓蒸汽滅菌法

高壓蒸汽滅菌用途廣，效率高，是微生物學(xué)實(shí)驗中最常用的滅菌方法。這種滅菌方法是基于水的沸點(diǎn)隨著(zhù)蒸汽壓力的升高而升高的原理設計的。當蒸汽壓力達到1.05kg/cm2時(shí)，水蒸氣的溫度升高到121℃，經(jīng)15～30min，可全部殺死鍋內物品上的各種微生物和它們的孢子或芽孢。一般培養基、玻璃器皿以及傳染性標本和工作服等都可應用此法滅菌（圖 3-4）。

5.2.1.3  操作方法和注意事項如下

5.2.1.3.1  加水

打開(kāi)滅菌鍋蓋，向鍋內加水到水位線(xiàn)。立式消毒鍋最好用已煮開(kāi)過(guò)的水，以便減少水垢在鍋內的積存。注意水要加夠，防止滅菌過(guò)程中干鍋。

5.2.1.3.2  裝料、加蓋

滅菌材料放好后，關(guān)閉滅菌器蓋，采用對角式均勻擰緊鍋蓋上的螺旋，使蒸汽鍋密閉，勿使漏氣。

5.2.1.3.3  排氣    

打開(kāi)排氣口(也叫放氣閥)。用電爐加熱，待水煮沸后，水蒸氣和空氣一起從排氣孔排出，當有大量蒸汽排出時(shí)，維持5min，使鍋內冷空氣完全排凈。

5.2.1.3.4  升壓、保壓和降壓

當鍋內冷空氣排凈時(shí)，即可關(guān)閉排氣閥，壓力開(kāi)始上升。當壓力上升至所需壓力時(shí)，控制電壓以維持恒溫，并開(kāi)始計算滅菌時(shí)間，待時(shí)間達到要求（一般培養基和器皿滅菌控制在121℃，20min）后，停止加熱，待壓力降至接近“0”時(shí)，打開(kāi)放氣閥。注意不能過(guò)早過(guò)急地排氣，否則會(huì )由于瓶?jì)葔毫ο陆档乃俣缺儒亙嚷�而造成瓶�(jì)纫后w沖出容器之外。

5.2.1.3.5  滅菌后的培養基空白培養

滅菌后的培養基放于37℃培養箱中培養，經(jīng)24h培養無(wú)菌生長(cháng)，可保存備用；斜面培養基取出后，立即擺成斜面后空白培養；半固體的培養基垂直放置凝成半固體深層瓊脂后，空白培養。

5.2.2  干熱滅菌法

通過(guò)使用干熱空氣殺滅微生物的方法叫干熱滅菌。一般是把待滅菌的物品包裝就緒后，放入電烘箱中烘烤，即加熱至160～170℃維持1～2h。

干熱滅菌法常用于空玻璃器皿、金屬器具的滅菌。凡帶有膠皮的物品，液體及固體培養基等都不能用此法滅菌。

5.2.2.1  滅菌前的準備

玻璃器皿等在滅菌前必須經(jīng)正確包裹和加塞，以保證玻璃器皿于滅菌后不被外界雜菌所污染。常用玻璃器皿的包扎和加塞方法如下：平皿用紙包扎或裝在金屬平皿筒內；三角瓶在棉塞與瓶口外再包以厚紙，用棉繩以活結扎緊，以防滅菌后瓶口被外部雜菌所污染；吸管以拉直的曲別針一端放在棉花的中心，輕輕捅入管口，松緊必須適中，管口外露的棉花纖維統一通過(guò)火焰燒去，滅菌時(shí)將吸管裝入金屬管筒內進(jìn)行滅菌，也可用紙條斜著(zhù)從吸管尖端包起，逐步向上卷，頭端的紙卷捏扁并擰幾下，再將包好的吸管集中滅菌。

5.2.2.2  干燥箱滅菌

將包扎好的物品放入干燥烘箱內，注意不要擺放太密，以免妨礙空氣流通；不得使器皿與烘箱的內層底板直接接觸。將烘箱的溫度升至160～170℃并恒溫1～2h，注意勿使溫度過(guò)高，超過(guò)170℃，器皿外包裹的紙張、棉花會(huì )被烤焦燃燒。如果是為了烤干玻璃器皿，溫度為120℃持續30分鐘即可。溫度降至60～70℃時(shí)方可打開(kāi)箱門(mén)，取出物品，否則玻璃器皿會(huì )因驟冷而爆裂。

用此法滅菌時(shí)，絕不能用油、蠟紙包扎物品。

5.2.2.3  火焰滅菌

直接用火焰灼燒滅菌，迅速徹底。對于接種環(huán)，接種針或其它金屬用具，可直接在酒精燈火焰上燒至紅熱進(jìn)行滅菌。此外，在接種過(guò)程中，試管或三角瓶口，也采用通過(guò)火焰而達到滅菌的目的。

6 結果

6.1記錄各種不同物品所用的滅菌方法及滅菌條件（溫度、壓力等）。

6.2試述高壓蒸汽滅菌的過(guò)程及注意事項。

7 思考

7.1 制備培養基的一般程序是什么？

7.2 做過(guò)本次實(shí)驗后，你認為在制備培養基時(shí)要注意些什么問(wèn)題？

7.3 滅菌在微生物學(xué)實(shí)驗操作中有何重要意義？

4 試述高壓蒸汽滅菌的操作方法和原理。

5 高壓蒸汽滅菌時(shí)應注意哪些事項？