實(shí)驗——微生物細胞大小的測定和顯微鏡直接計數

目的

1.1  學(xué)習接目測微計的校正方法， 了解血球計數板的構造和計數原理

1.2 學(xué)習使用顯微鏡測微尺測定微生物細胞大小，  掌握用血球計數板測定微生物細胞總數的方法。

2  原理

微生物細胞的大小是微生物分類(lèi)鑒定的重要依據之一。微生物個(gè)體微小，必須借助于顯微鏡才能觀(guān)察，要測量微生物細胞大小，也必須借助于特殊的測微計在顯微鏡下進(jìn)行測量。

顯微測微計由鏡臺測微計和目鏡測微計兩部分組成。后者可直接用于測量細胞大小。它是一塊圓形玻片(圖7—1)，其中央有精確等分到度，測量時(shí)將其放在接目鏡中的隔板上。由于目鏡測微計所測量的是微生物細胞經(jīng)過(guò)顯微鏡放大之后所成像的大小，刻度實(shí)際代表的長(cháng)度隨使用的目鏡和物鏡放大倍數及鏡筒的長(cháng)度而改變，所以，使用前須先用鏡臺測微計進(jìn)行標定，求出某一放大率下，目鏡測微計每一小格所代表的長(cháng)度，然后用目鏡測微計直接測被測對象的大小。鏡臺測微計是一塊中央有精確刻玻片(圖7—1)，刻度的總長(cháng)為lmm，等分為100小格，每小格長(cháng)10um，專(zhuān)用于對目鏡測微計進(jìn)行標定的。

3  材料

3.1  器械

顯微鏡、目鏡測微尺、鏡臺測微尺，載玻片、蓋玻片、血球計算板、擦鏡紙、吸水紙、玻片架、腎形盤(pán)、洗瓶、接種環(huán)、酒精燈、火柴、滴管。

3.2  菌種

培養48h的啤酒酵母斜面菌體和菌懸液。

3.3  革蘭氏染液

4流程

4.1 置目測微計→置臺測微計→標定目測微計→測菌體大小→記錄結果→用畢擦拭干凈

4.2 檢查計數板→稀釋樣品→加樣→計數→計算→清洗

5  步驟

5.1  微生物菌體大小的測定

5.1.1  目鏡測微尺的校正

5.1.1.1  更換目鏡鏡頭 

更換目鏡測微尺鏡頭（標記為PF）；或者取下目鏡上部或下部的透鏡，在光圈的位置上安上目鏡測微尺，刻度朝下，再裝上透鏡，制成一個(gè)目鏡測微尺的鏡頭。

5.1.1.2  某一倍率下標定目鏡刻度

將鏡臺測微尺置于載物臺上，使刻度面朝上，先用低倍鏡對準焦距、看清鏡臺測微尺的刻度后，轉動(dòng)目鏡，使目鏡測微尺與鏡臺測微尺的刻度平行，移動(dòng)推動(dòng)器使兩尺重疊，并使二尺的左邊的某一刻度相重合，向右尋找另外二尺相重合的刻度。記錄兩重疊刻度間的目鏡測微尺的格數和鏡臺測微尺的格數(圖7-1C)。

5.1.1.3  計算該倍率下目鏡刻度 

目鏡測微尺每格長(cháng)度=鏡臺測微尺格數/目鏡測微尺格數xl0um

5.1.1.4  標定并計算其他放大倍率下的目鏡刻度

以同樣方法分別在不同倍率的物鏡下測定目鏡測微尺每格代表的實(shí)際長(cháng)度。如此測定后的測微尺的長(cháng)度，僅適用于測定時(shí)使用的顯微鏡以及該目鏡與物鏡的放大倍率。

5.1.2  菌體大小的測定

5.1.2.1  將啤酒酵母制成水浸片。

5.1.2.2  大小換算

將標本先在低倍鏡下找到目的物，然后在高倍鏡下用目鏡測微尺測定每個(gè)菌體長(cháng)度和寬度所占的刻度，即可換算成菌體的長(cháng)和寬。

5.1.2.3  求平均值

一般測量微生物細胞的大小，用同一放大倍數在同一標本上任意測定l0一20個(gè)菌體后，求出其平均值即可代表該菌的大小。

5.2  用血球計數板測定微生物細胞的數量

5.2.1  檢查血球計數板 

取血球計數板一塊，先用顯微鏡檢查計數板的計數室，看其是否沾有雜質(zhì)或干涸著(zhù)的菌體，若有污物則通過(guò)擦洗、沖洗，使其清潔。鏡檢清洗后的計數板，直至計數室無(wú)污物時(shí)才可使用。

5.2.2  稀釋樣品

將培養后的酵母培養液振蕩振搖混勻，然后作一定倍數的稀釋。稀釋度選擇以小方格中的分布的菌體清晰可數為宜。一般以每小格內含4～5個(gè)菌體的稀釋度為宜。

5.2.3  加樣

取出一塊干凈蓋玻片蓋在計數板中央。用滴管取1滴菌稀釋?xiě)乙鹤⑷肷w玻片邊緣，讓菌液自行滲入，若菌液太多可用吸水紙吸去。靜置5—10分鐘。

5.2.4  鏡檢

待細胞不動(dòng)后進(jìn)行鏡檢計數。先用低倍鏡找到計數室方格后，再用高倍鏡測數。一般應取上下及中央五個(gè)中格的總菌數。計數時(shí)若遇到位于線(xiàn)上的菌體，一般只計數格上方（下方）及右方（左方）線(xiàn)上的菌體。每個(gè)樣品重復3次。

5.2.5  計算 

取以上計數的平均值，按下列公式計算出每毫升菌液中的含菌量。

菌體細胞數（cfu/mL）＝小格內平均菌體細胞數×400×104×稀釋倍數

5.2.6  清洗 

計數板用畢后先用95%的形酒精輕輕擦洗，再用蒸餾水淋洗，然后吸干，最后用擦鏡紙揩干凈。若計數的樣品是病原微生物，則須先浸泡在5%石炭酸溶被中進(jìn)行消毒，然后再行清洗。清洗后放回原位，切勿用硬物洗刷。

圖7-2 血細胞計數板

6  結果

6.1計算出目鏡測微尺在低、高倍鏡下的刻度值。

6.2 記錄菌體大小的測定結果。

6.3 計算樣品中酵母菌濃度。

7  思考

7.1  為什么隨著(zhù)顯微鏡放大倍數的改變，目鏡測微計每格相對的長(cháng)度也會(huì )改變？能找出這種變化的規律嗎？

7.2  根據測量結果，為什么同種酵母菌的菌體大小不完全相同？

7.3  能否用血球計數板在油鏡下進(jìn)行計數？為什么？

7.4 根據自己體會(huì )，說(shuō)明血球計數板計數的誤差主要來(lái)自那些方面？如何減少誤差？ 

8 附錄

目鏡測數尺有兩種：一是特制的目鏡鏡頭，鏡片上刻有50等分或100等分的刻度，使用時(shí)直接安裝在顯微鏡上，取代沒(méi)有刻度的目鏡鏡頭；另一種是一塊直徑大約17.5 mm的圓玻璃片，其中央刻有50等分或100等分的刻度(圖7-1A)，使用時(shí)將該玻璃片安裝在原來(lái)的目鏡鏡頭上即可。由于不同的顯微鏡放大倍數不同，既使同一顯微鏡在不同的目鏡、物鏡組合下其放大倍數也不同，故目鏡測微尺每格實(shí)際表示的長(cháng)度隨顯微鏡放大倍數不同而異。也就是說(shuō)，目鏡測微尺上的刻度只代表相對的長(cháng)度。因此在使用前須用鏡臺測微尺校正，以確定在一定放大倍數下目鏡測微尺的每格長(cháng)度。

血球計數板是一塊特別的厚玻片，玻片中央分剖成兩個(gè)平面，上面各刻有9區，中央一區為計數室，供計數用(圖7-2A)，此區的長(cháng)和寬各為1mm。中央平面兩側有小溝，小溝外有兩條突起的平臺，平臺比中央平面高0.1mm，因此計數室體積為0.1mm³，容積為10^-4ml。通常計數室分為25個(gè)大格，每大格又分為16個(gè)小格，每小格容積為4×10^-6ml，即lml菌液容積相當于400萬(wàn)個(gè)小格體積。因此只要將細胞懸液注人計算室，計算出一定數量小格的平均菌數即可算出每毫升的細胞數。