實(shí)驗——微生物菌種常規保藏方法

菌種是一種重要的生物資源，菌種保藏是重要的微生物基礎工作。菌種保藏就是利用一切條件使菌種不死、不衰、不變，以便于研究與應用。

1 目的

1.1 了解菌種保藏的基本原理

1.2 掌握幾種常用的菌種保藏方法。

2 原理

菌種保藏的方法很多。其原理卻大同小異，不外乎為優(yōu)良菌株創(chuàng )造一個(gè)適合長(cháng)期休眠的環(huán)境,即干燥、低溫、缺乏氧氣和養料等。使微生物的代謝活動(dòng)處于最低的狀態(tài)，但又不至于死亡，從而達到保藏的目的。依據不同的菌種或不同的需求，應該選用不同的保藏方法。一般情況下，斜面保藏、半固體穿刺,石蠟油封存和砂土管保藏法較為常用，也比較容易制作。

3 材料

3.1菌株 

待保藏的適齡菌株斜面

3.2培養基  

肉湯蛋白胨斜面，半固體及液體培養基。

3.3 試劑

10%HCl無(wú)水氯化鈣、石蠟油、五氧化二磷。

3.4 器具

用于菌種保藏的小試管(10*100毫米)數支、5毫升無(wú)菌吸管、l毫升無(wú)菌吸管等、滅菌鍋、真空泵、干燥器、冰箱無(wú)菌水、篩子(40目、120目)、標簽、接種針、接種環(huán)、棉花、牛角匙等等。

4 流程

斜面保藏→半固體穿刺保藏→石蠟油封存→砂土管保藏 

5 步驟

5.1斜面保藏

5.1.1流程

標記試管→接種→培養→保藏

5.1.2步驟

5.1.2.1貼標簽

取無(wú)菌的肉湯蛋白胨斜面數支。在斜面的正上方距離試管口2-3厘米處貼上標簽。在標簽紙上寫(xiě)明接種的細菌菌名、培養基名稱(chēng)和接種日期。

5.1.2.2斜面接種

將待保藏的細菌用接種環(huán)以無(wú)菌操作在斜面上作劃線(xiàn)接種。

5.1.2.3培養

置37恒溫箱中培養48小時(shí)。

5.1.2.4保藏

斜面長(cháng)好后，直接放入4℃的冰箱中保藏。這種方法一船可保藏三個(gè)月至半年。

5.2半固體穿刺保藏

5.2.1流程

標記試管→穿刺接種→培養→保藏

5.2.2 步驟  

5.2.2.1貼標簽

取無(wú)菌的半固體肉湯蛋白等直立柱數支，貼上標簽，注明細菌菌名、培養基名稱(chēng)和接種日期。

5.2.2.2穿刺接種

用接種針以無(wú)菌方式從待保藏的細菌斜面上挑取菌種，朝直立柱中央直刺至試管底部，然后又沿原線(xiàn)拉出。 

5.2.2.3培養

置37恒溫箱中培養48小時(shí)。

5.2.4保藏

半固體直立柱長(cháng)好以后，放入4℃的冰箱中保藏。這種方法一般可保藏半年至一年。

5.3石蠟油封存

5.3.1流程

標記試管→接種→培養→加石蠟油→保藏

5.3.2 步驟

5.3.1標記

同5.1.2.1

5.3.2接種

同5.1.2.2

5.3.3培養

同5.1.2.3

5.3.4加石蠟油

無(wú)菌操作下將5毫升石蠟油到培養好的菌種上面，加入的量以超過(guò)斜面或直立柱1厘米高為宜。

5.3.5保藏：石蠟油封存以后，同樣放入4℃冰箱中保存。也可直接放在低溫干燥處保藏。這種方法保藏期一般為一至二年。

5.4砂土管保藏

5.4.1 流程

制沙土管→滅菌→制菌液→加樣→干燥→保藏

5.4.2 步驟

5.4.2.1制作沙土管

選取過(guò)40目篩的黃砂，酸洗，再水洗至中性，烘干備用；過(guò)120目篩子的黃土備用；按1份土加4份砂的比例均勻混合后，裝入小試管，裝量1厘米左右。

5.4.2.2滅菌

加壓蒸汽滅菌，直至檢測無(wú)菌為止。

5.4.2.3制備菌液

取3毫升無(wú)菌水至待保藏的菌種斜面中，用接種環(huán)輕輕刮下菌苔。震蕩制成菌懸液。

5.4.2.4加樣

用1毫升吸管吸取上述懸液0.1毫升至砂土管，再用接種環(huán)拌勻。

5.4.2.5干燥

把裝好菌液的砂土管放入干燥器或同時(shí)用真空泵連續抽氣，使之干燥。

5.4.2.6保藏

干燥后的砂土管可直接放入冰箱中保藏；也可以用石蠟封住棉花塞后放冰箱中保藏。