實(shí)驗——Ames法檢測誘變劑和致癌劑

1 目的 
1.1 理解Ames法快速檢測誘變劑和致癌劑原理。 
1.2 掌握Ames法快速檢測誘變劑和致癌劑方法。 
2 原理 
食品安全無(wú)論如何怎樣強調都不會(huì )過(guò)分，迅速而準確地檢測致癌物質(zhì)是食品安全問(wèn)題的重要方面。Ames等人發(fā)現90％以上的誘變劑是致癌物質(zhì)，由此，他們創(chuàng )立了一種快速測定法，即利用是否能引起鼠傷寒沙門(mén)氏菌組氨酸缺陷型（hisˉ）菌株的回復突變來(lái)判斷化學(xué)物質(zhì)是否誘變劑和致癌劑，并能區別突變的類(lèi)型（置換或移碼突變）。 
這組檢測菌株含有下列突變：① 組氨酸基因突變（hisˉ），根據選擇性培養基上出現his＋的回復突變率可測出誘變劑或致癌物的誘變效率。②脂多糖屏障丟失（rfa），該菌株的細胞壁基因有缺陷，使待測物容易進(jìn)入細胞內。③紫外線(xiàn)切除修復系統缺失（△uvrB）,同時(shí)其附近的硝基還原酶和生物素基因缺失（bioˉ），使致癌物引起的遺傳損傷的修復降低到最小的程度。④抗藥性標記R，表示某些菌株具有抗氨芐青霉素（ampicillin）的質(zhì)粒，從而提高了檢出的靈敏性。 
常用的幾株鼠傷寒沙門(mén)氏茵命名為：TAl535、TAl537、TAl538、TA 98、TAl 00、TA 97及TAl02等。這是一系列特異的營(yíng)養缺陷型沙門(mén)氏菌株。檢測菌株TA1535含有一個(gè)堿基置換突變，能檢測引起置換突變的誘變劑。TA1537在重復的G-C堿基對序列中有一個(gè)移碼突變，能檢測引起移碼的誘變劑。TA100和TA98就是上述菌株分別加上一個(gè)抗藥性轉移因子pKM101質(zhì)粒后的菌株（質(zhì)粒易丟失，故應盡可能減少傳代）。 
有的致癌物的誘變性是被哺乳動(dòng)物肝細胞中的羥化酶系統活化的，而細菌卻沒(méi)有這種酶系統，故加入鼠肝勻漿的酶系統能增加檢測的靈敏度。 
鼠傷寒沙門(mén)氏菌，對化學(xué)致癌物來(lái)說(shuō)，不是決定性的試驗。但是，目前各地資料表明，Ames試驗陽(yáng)性和致癌之間有十分明顯的相關(guān)性。根據Ames本人對300余種化學(xué)品進(jìn)行的微生物誘變試驗及動(dòng)物誘癌實(shí)驗對比，發(fā)現二者之間存在著(zhù)非常明顯的一致性。 
Ames試驗的優(yōu)點(diǎn)是，方法靈敏，檢出率高，經(jīng)試驗有90％的化學(xué)致癌物經(jīng)都可獲得陽(yáng)性結果；加之方法比較簡(jiǎn)便、易行，不需特殊器材，容易推廣。缺點(diǎn)是，微生物的DNA修復系統比哺乳動(dòng)物簡(jiǎn)單，基因不如哺乳動(dòng)物多，不能完全代表哺乳動(dòng)物的實(shí)際情況。盡管如此，由于存在著(zhù)上述的優(yōu)勢，故目前在致突變試驗中占重要位置，為首選的試驗方法。 
3 材料   
3.1 菌種  
鼠傷寒沙門(mén)氏菌（Salmonella typhimurium）的幾個(gè)測試菌株，其突變標記如下表（略）： 
3.2 培養基   
3.2.1 底層培養基 
葡萄糖20g  檸檬酸2g  K2HPO4-3H2O 3.5g  MgSO4•7H2O 0.2g  瓊脂（優(yōu)質(zhì)）12g   蒸餾水 1000ml  pH7.0  8磅滅菌15分鐘  用量1000ml。 
3.2.2 組氨酸-生物素混合液 
稱(chēng)31mg L-鹽酸組氨酸和49mg生物素溶于40ml蒸餾水中，備用。 
3.2.3 上層培養基 
0.5g氯化鈉，0.6g優(yōu)質(zhì)瓊脂，加90ml蒸餾水，加熱熔化后定容，然后加入10ml組氨酸-生物素混合液，搖勻后分裝小試管80支，每支3ml，8磅滅菌15分鐘。用量250ml。 
3.2.4 “素瓊脂” 
0.5g氯化鈉，0.6g優(yōu)質(zhì)瓊脂，加90ml蒸餾水，加熱熔化后定容。分裝小試管25支，每支3ml，8磅滅菌15分鐘。用量100ml。 
3.2.5 肉湯培養基 
牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂20g，自來(lái)水1000ml。調節pH至7.2～7.4，121℃滅菌20分鐘。用量500ml。 
3.2.6 肉湯培養液 
在肉湯培養基未加瓊脂前，分裝10支試管，每支5ml。 
3.3 肝勻漿S-9 
選成年雄性大白鼠3只（每只體重在300g左右），稱(chēng)重，按每公斤體重腹腔注射誘導物五氯聯(lián)苯油溶液2.5ml（五氯聯(lián)苯用玉米油配制，濃度為200mg/ml）提高酶活力。注射后第5天殺鼠，殺前大鼠禁食24h，取3只大白鼠的肝臟合并后稱(chēng)重，用0.15M KCl溶液洗滌3次，剪碎，每克肝臟（濕重）加3ml 0.15M KCl溶液，制成勻漿，離心（9000轉/分 10分鐘），取上清液（即S-9）分裝小試管，每管1～2ml，液氮速凍，-20℃冷藏備用。所用器皿、刀剪、溶液都需保持無(wú)菌，并在0～4℃下（也可在冰浴中）操作。 
3.4 大鼠肝勻漿混合液 
制備方法如下： 
3.4.1 0.2M pH7.4磷酸緩沖液 
Na2HPO4•12H2O  7.16g， KH2PO4 2.72g，加水至100ml，滅菌后備用。 
3.4.2 鹽溶液 
MgCl2 8.1g，KCl 12.3g，加水至100ml，滅菌后備用。 
3.4.3 NADP（輔酶Ⅱ）和G-6-P（葡萄糖-6-磷酸）使用液 
每100ml使用液含NADP 297mg，G-6-P 152mg，0.2 M pH 7.4的磷酸緩沖液50ml，鹽溶液2ml，加水至100ml。細菌過(guò)濾器過(guò)濾除菌，經(jīng)無(wú)菌試驗后分裝成每瓶10ml的小瓶，-20℃貯存備用。 
3.4.4 S-9混合液 
取2 ml S-9加入10ml NADP和G-6-P 使用液（將低溫貯存S-9 和使用液室溫下融化后現配現用），混合液置冰浴中，用后多余部分棄去。 
3.5 試劑 
3.5.1 亞硝基胍（50μg/ml，250μg/ml，500μg/ml，用甲酰胺0.05ml助溶后用pH 6 的0.1 M 磷酸緩沖液配制）；氨芐青霉素（8mg/ml，用0.02 N的NaOH 配制）；黃曲霉毒素B1（50μg/ml，5μg/ml）；結晶紫（1mg/ml）；生理鹽水，氯化鉀（15M）。 
3.6 器皿 
3.6.1 常用器皿 
培養皿；移液管；試管；15w紫外燈；水浴鍋；圓濾紙片（直徑10mm的厚濾紙）若干；鑷子；黑紙。 
3.6.2 制備肝勻漿的器皿 
注射器5m；臺秤；剪刀）；燒杯；勻漿管；高速離心機；血清瓶。 
４流程 
4.1 測試菌株的鑒定 
4.2 NTG和黃曲霉毒素B誘變作用的檢測 
細菌培養→紙片點(diǎn)樣檢測→培養皿摻人檢測→加S9檢測法→陽(yáng)性對照和S9活性鑒定 
→誘變性的定性鑒定→誘變性的定量鑒定→數據記錄和分析 
５步驟 
５.1 測試菌株的鑒定 
5.1.1 組氨酸和生物素標記的鑒定 
將測試菌株TA1535、TA1537、TA100、TA98、S-CK 等于實(shí)驗前一天分別挑取一環(huán)到5ml肉湯液中，37℃培養過(guò)夜，離心洗滌4次。將底層培養基熔化后倒10皿。取10支“素瓊脂”熔化后在48℃水浴中保溫。分別吸取各試驗菌液0.1ml到各試管中，搓勻后立即傾注到底層平板上，每個(gè)菌株2皿。用蠟筆劃好3個(gè)區，在A(yíng)點(diǎn)上加微量組氨酸固體（加量約芝麻粒的1/2），B點(diǎn)上加微量組氨酸和生物素，C點(diǎn)作空白對照（圖7-1），37℃培養2天觀(guān)察結果。證明除了對照菌株外，其它都是組氨酸和生物素缺陷型。 
5.1.2 脂多糖屏障丟失（rfa）的鑒定 
倒好肉湯培養基平板10皿，取10支“素瓊脂”試管按5.1.1的方法傾注帶菌的平板，各菌株2皿，在皿中心放一直徑為O．6cm的圓形濾紙，滴上10μl結晶紫溶液(1mg／ml)，37℃培養過(guò)夜后觀(guān)察結果，測量抑制圈直徑（圖7-1）。 
5.1.3 抗藥性鑒定 
倒好肉湯培養基平板4皿，在平板中心加0.01ml氨芐青霉素，用接種環(huán)輕輕涂成一條帶，置37℃待干。用蠟筆劃好記號，分別挑取一環(huán)試驗菌株，按與氨芐青霉素帶垂直的方向劃線(xiàn)，每皿間隔劃三個(gè)菌株，每個(gè)菌株劃兩皿，37℃培養過(guò)夜，觀(guān)察結果（圖7-1）。 
5.1.4 紫外線(xiàn)切除修復缺失（△uvrB）的鑒定 
倒好肉湯培養基平板4皿，每皿劃三條不同試驗菌的菌帶，每個(gè)菌株劃兩皿（圖7-1）。用滅菌的黑紙遮蓋培養皿的1/2，置15瓦紫外燈下（距離30cm），照射8秒鐘，在暗室內紅燈下操作，照好后用黑紙包好，37℃培養過(guò)夜，觀(guān)察結果。 
5.2 NTG的誘變作用 黃曲霉毒素B1的誘變作用 
5.2.1 誘變作用的初檢（點(diǎn)滴法） 
5.2.1.1 NTG的誘變作用 
倒好底層培養基平板18皿。融化上層培養基18支放入48℃水浴中保溫。將在37℃培養約17h的TA1535，TA100，TA98三個(gè)菌株的菌液稀釋20倍后，各吸0.2ml菌液入上層培養基試管，搓勻后迅速傾入底層平板上，每個(gè)菌株6皿。待凝固后于皿中心放入厚的圓濾紙片，分別加50μg/ml，250μg/ml，500μg/ml的NTG各0.02ml到濾紙片上，即每皿分別是1μg、5μg和10μg，37℃培養兩天后觀(guān)察結果。 
5.2.1.2 黃曲霉毒素B1的誘變作用 
有些誘變劑和致癌劑要經(jīng)肝勻漿酶系統活化后才能被測出，黃曲霉毒素就是這類(lèi)物質(zhì)之一。在測試的前一周事先制備好肝勻漿S-9和含有6-P-G與NADP的pH 7.4 的鹽溶液，分別低溫保存，實(shí)驗前將這兩部分化凍后按所需量混合制成S-9混合液，本實(shí)驗取2ml S-9 加入10ml pH 7.4的鹽溶液，置冰浴中備用備。 
倒好底層培養基平板24皿，熔化上層培養基24支，放入48℃水浴中保溫。將在37℃培養約17小時(shí)的TA1535，TA100，TA98三個(gè)菌株的菌液稀釋20倍后，各吸0.2ml菌液入上層培養基試管，每個(gè)菌株8支，其中4株加S-9混合液各0.2ml，另4株不加，搓勻后迅速傾入底層平皿（S-9混合液加入后要立即傾入平皿，以免酶在48℃中失活）。待凝固后在皿中心放一厚的圓濾紙片，取2皿已加S-9混合液和2皿不加者分別加0.02ml的黃曲霉毒素B1（每ml含有50μg黃曲霉毒素B1）。37℃培養兩天后觀(guān)察結果。 
5.2.2 突變頻率的測定 
點(diǎn)試法簡(jiǎn)便，但僅能作為初步的定性測定，只有嚴格地測定了誘發(fā)回復突變頻率后才能得到陽(yáng)性或陰性的肯定結論。 
5.2.2.1 NTG誘發(fā)回復突變的頻率 
倒好底層培養基平板12皿，熔化上層培養基12支，48℃水浴保溫。分別吸取稀釋20倍的菌液各0.2ml和NTG（50μg/ml）0.1ml，放入上層試管中，搓勻后立即傾注到底層平板上，每個(gè)菌株2皿，每皿含NTG 5μg。另外分別吸取0.2ml菌液入上層試管中，搓勻后立即傾注到底層平板上作對照，每個(gè)菌株2皿，37℃培養兩天后觀(guān)察結果，計算自發(fā)回復突變率和誘發(fā)回復突變率。凡誘發(fā)回復率超過(guò)自發(fā)回復突變率2倍以上者屬于陽(yáng)性，低于2倍者屬于陰性。 
為了計算突變頻率，必須同時(shí)測定各菌液的活菌數目。為此需將上述三菌株的20倍稀釋液再稀釋至10-5、10-6后各取0.1ml；與肉湯培養基混皿，各菌株4皿，37℃培養兩天后計數。 
5.2.2.2黃曲霉毒素B1誘發(fā)回復突變的頻率 
倒好底層培養基平板24皿，熔化上層培養基24支， 48℃水浴保溫。分別吸取稀釋20倍的菌液各0.2ml到上層培養基試管，每個(gè)菌株8支，其中4株加S-9混合液各0.2ml，另4株不加。分別取2支加S-9混合液和2支不加者到含有5μg/ml的黃曲霉毒素B1各0.2ml（即每皿含有1μg B1），搓勻后立即傾入底層平板上。其余4支不加B1者也搓勻傾入底層平板上。待凝固后置37℃培養兩天后計數。 
活菌計數與4.2.2.1相同。 
6 結果 
6.1 記下測試菌株的鑒定結果 
6.1.1 組氨酸和生物素標記的鑒定。 
6.1.2 脂多糖屏障丟失的鑒定。 
6.1.3 抗藥性的鑒定。 
6.1.4 紫外線(xiàn)切除修復缺失的鑒定。 
6.2 把NTG和黃曲霉毒素B1誘變作用的初檢（點(diǎn)滴法）結果記在下表中 
表7-2  NTG誘發(fā)回復突變的初檢結果 
表7-3  黃曲霉毒素B1誘發(fā)回復突變的初測結果 
6.3 誘發(fā)回復突變頻率的測定結果 
表7-4  NTG誘發(fā)回復突變頻率（％） 
表7-5 黃曲霉毒素B1誘發(fā)回復突變頻率（％） 
菌株    誘發(fā)回復突變（加黃曲霉毒素B1）    （自發(fā)回復突變（不加B1） 
 7 思考 
7.1 為什么可以用細菌檢測致癌物質(zhì)？ 
7.2 對致癌物質(zhì)檢測為什么選用回復突變基因作標記？ 
8 注意事項 
8.1 鼠傷寒沙門(mén)氏菌是條件致病菌，所以用過(guò)的器皿應放入石碳酸中或進(jìn)行煮沸滅菌，培養基也應經(jīng)煮沸后倒棄。 
8.2 肝勻漿的提取應重視無(wú)菌操作，并應做無(wú)菌測定，入無(wú)低溫條件時(shí)，提取過(guò)程盡可能用冰浴保持低溫。S-9混合液要在使用時(shí)隨時(shí)配制。 
8.3 倒底層培養基時(shí)，待融化好的培養基冷卻到45～50℃時(shí)倒皿，盡可能減少平板表面的水膜，防止上層“滑坡”，能預先在37℃過(guò)夜則更好。 
8.4 NTG和黃曲霉毒素都是強烈致癌物，操作時(shí)要膽大心細，切勿用嘴吸取，用過(guò)的器皿要用水大量沖洗或放入0.5M硫代硫酸鈉中解毒后方可清洗。 
6 結果  
霍德華霉菌計測數值，又稱(chēng)霉菌數，用百分比表示。其含義如下： 
將0.15mm3標準樣液，均勻地攤布成厚0.1mm，直徑為1.382mm，其面積為1.5mm2的標準視野，在顯微鏡下檢查。按100個(gè)視野數計算，其中發(fā)現有霉菌菌絲存在的視野數（即陽(yáng)性視野數）。 
根據霉菌數含義，其計算公式如下： 
                 
霉菌數（％）＝陽(yáng)性視野數/50×100％     
                    
舉例如圖18-6：記錄的陽(yáng)性視野數，片1為15，片2為16，則樣品的霉菌數為： 
                   
樣品霉菌數（％）＝（15＋16）/50×1/2×100％＝31％ 
實(shí)驗要注意下述三個(gè)問(wèn)題： 
6.1 番茄醬霉菌數指標 
部頒標準為陽(yáng)性視野不超過(guò)40％，在國際貿易中，合同上無(wú)要求時(shí)按部頒標準執行，合同上有要求時(shí)按合同執行。 
6.2 制片數量 
每抽取一罐樣品制兩個(gè)片子，每片觀(guān)察50個(gè)視野，如果超過(guò)標準指標，應該繼續制片，但片子數量不得少于3片即150個(gè)視野，如果計測結果相近時(shí)，可取其平均值。 
6.3 復檢數量 
如對抽樣結果有異議，，應加倍抽樣。全部合格，作為合格處理，其中有一罐不合格，該批作為不合格處理。 
五  報告要求  
    作好計測記錄，按記錄計算計測結果并作報告

 

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