實(shí)驗——食品中病原性大腸埃希氏菌的檢驗

1 目的

1.1 了解病原性大腸艾希氏菌的種類(lèi)于非病原性大腸艾希氏菌的區別。

1.2 掌握病原性大腸艾希氏菌檢驗的原理和方法。

2 原理

正常情況下，大腸艾希氏菌不致病，而且還能合成維生素B和K，生產(chǎn)大腸菌素，對

機體有利。但當機體抵抗力下降或大腸艾希氏菌侵入腸外組織或器官時(shí)，可作為條件性致病菌而引起腸道外感染。有些血清型可引起腸道感染，已知的引起致病性大腸艾希氏菌有四類(lèi)，即產(chǎn)腸毒素大腸艾希氏菌、出血性大腸艾希氏菌、腸道侵襲性大腸艾希氏菌和腸道致病性大腸艾希氏菌，后者主要引起新生兒的腹瀉。帶菌的牛和豬是傳播本菌引起食物中毒的重要原因，人的帶菌亦可污染食品，引起中毒。

3 材料

3.1 菌種和食品檢樣

產(chǎn)不耐熱腸毒素（LT）和產(chǎn)耐熱腸毒素（ST）大腸艾希氏菌標準菌株、食品檢樣。

3.2 試劑和培養基 

多粘菌素B紙片；0.1％硫椰汞溶液；2％伊文思藍溶液；革蘭氏染色液。

乳糖膽鹽發(fā)酵管；營(yíng)養肉湯；腸道茵增菌肉湯；麥康凱瓊脂；伊紅美藍瓊脂(EMB)；三糖鐵瓊脂(TSI)；克氏雙糖鐵瓊脂(KI)；糖發(fā)形管(乳糖、鼠李糖、木糖和甘露醇)；賴(lài)氨酸脫羧酶試驗培養基；尿素瓊脂(pH7．2)；氰化鉀培養基；蛋白陳水、靛基質(zhì)試劑；半固體瓊脂；Honda氏產(chǎn)毒肉湯；E1ek氏培養基；氧化酶試劑。 

3.3 動(dòng)物和血清

小白鼠：1日齡一4日齡；致病性大腸艾希氏茵診斷血清；侵襲性大腸艾希氏菌診斷血清；產(chǎn)腸毒素大腸艾希氏菌診斷血清；出血性大腸艾希氏茵診斷血清；產(chǎn)腸毒素大腸艾希氏茵LT和ST酶標診斷試劑盒；抗LT抗毒素。

3.3 設備與材料  

天平；均質(zhì)器或乳缽；溫箱(36土1)℃、42℃；水�。猴@微鏡；離心機；酶標儀；細菌濃度比濁管；滅菌廣口瓶；滅菌三角燒瓶；滅菌平皿；滅菌試管；滅菌吸管；橡膠乳頭；載玻片；酒精燈；滅茵金屬匙或玻璃棒；接種棒、鎳鉻絲；)接種棒、鎳鉻絲；試管架、試管簍；冰箱；注射器；滅菌的刀子、剪子、鑷子；硝酸纖維素濾膜。

4 流程

 

5 操作方法

5.1 增菌

樣品采集后應盡快檢驗。以無(wú)菌操作稱(chēng)取檢樣25g，加在225mL營(yíng)養肉湯中，以均質(zhì)器打碎1min或用乳缽加滅菌砂磨碎。取出適量，接種乳糖膽鹽培養基，以測定大腸菌群MPN，其余的移入500mL廣口瓶?jì)�，�?6土1℃培養6h。挑取1環(huán)，接種于1管30mL腸道菌增菌肉場(chǎng)內，于42℃培養18h。

5.2 分離

將乳糖發(fā)酵陽(yáng)性的乳糖膽鹽發(fā)酵管和增菌液分別劃線(xiàn)接種麥康凱或伊紅美藍瓊脂乎板；污染嚴重的檢樣，可將檢樣勻液直接劃線(xiàn)接種麥康凱或伊紅美藍乎板，于36土1℃培養18h一24h，觀(guān)察菌落。不但要注意乳糖發(fā)酵的菌落，同時(shí)也要注意乳糖不發(fā)酵和遲緩發(fā)酵的菌落。

5.3 生化試驗

5.3.1 自鑒別平板上直接挑取數個(gè)菌落分別接種三糖鐵(TSl)或克氏雙糖鐵瓊脂(KI)。同時(shí)將這些培養物分別接種蛋白胨水、半固體、pH7．2尿素、瓊脂、KCN肉湯和賴(lài)氨酸脫羧酶試驗培養基。以上培養物均在36℃培養過(guò)夜。

5.3.2 TSI斜面產(chǎn)酸或不產(chǎn)酸，底層產(chǎn)酸，H2S陰性，KCN陰性和尿素陰性的培養物為大腸艾希氏茵。TSI底層不產(chǎn)酸，或H2S、KCN、尿素有任一項為陽(yáng)性的培養物，均非大腸艾希氏菌。必要時(shí)做氧化酶試驗或革蘭氏染色鏡檢。

5.4 血清學(xué)試驗  

5.4.1 假定試驗

挑取經(jīng)生化試驗證實(shí)為大腸艾希氏菌的瓊脂培養物，用致病性大腸艾希氏菌、侵襲性大腸艾希氏苗、產(chǎn)腸毒素大腸艾希氏茵多價(jià)O血清和出血性大腸艾希氏苗O157，血清做玻片凝集試驗。當與某一種多價(jià)O血清凝集時(shí)，再與該多價(jià)血清所包含的單價(jià)O血清做試驗。致病性大腸艾希氏茵所包括的O抗原群見(jiàn)表9—1。如與某一個(gè)單價(jià)O血清呈現強凝集反應，即為假定試驗陽(yáng)性。

5.4.2 證實(shí)實(shí)驗

制備O抗原懸液，稀釋至與MacFarland 3號比濁管相當的濃度。原效價(jià)為1:160—1:320的O血清，用0.％鹽水稀釋至1:40。稀釋血清與抗原懸液在10mm×75mm試管內等量混合，做試管凝集試驗�；靹蚝蠓庞�50℃水浴箱內，經(jīng)16h后觀(guān)察結果。如出現凝集，可證實(shí)為該O抗原。

5.5 腸毒素試驗

5.5.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測LT和ST

5.5.1.1 產(chǎn)毒培養 

將試驗菌株和陽(yáng)性及陰性對照菌株分別接種于0.6mLCAYE培養基內，37℃振蕩培養過(guò)夜。加入20000IU／ml的多粘菌素B0.05mL，于37℃培養1h，4000r／min離心15min，分離上清液，加入0.1％硫柳汞0.05ml，于4℃保存待用。

5.5.1.2  LT檢測方法(雙抗體夾心法)

包被：先在產(chǎn)腸毒素大腸艾希氏茵CT和ST酶標診斷試劑盒中取出包被用LT抗體管，加入包被液0.5ml，混勻后全部吸出于3.6ml包被液中混勻，以每孔100μl量加入到40孔聚苯乙烯硬反應板中，第一孔留空作對照，于4℃冰箱濕盒中過(guò)夜。

洗板：將板中溶液甩去，用洗滌液I洗3次，甩盡液體，翻轉反應板，在吸水紙上拍打，去盡孔中殘留液體。

封閉：每孔加100μL封閉液，于37℃水浴中lh。

洗板：用洗滌液II洗3次，操作同上。

加樣本：每孔分別加多種試驗菌株產(chǎn)毒培養液100μl，37℃水浴中lh。

洗板：用洗滌液II洗3次，操作同上。

加酶標抗體：先在酶標LT抗體管中加0.5ml稀釋液，混勻后全部吸出于3.6ml稀釋液中混勻，每孔加100μl，37℃水浴中1h。

洗板：用洗滌液II洗3次，操作同上。

酶底物反應：每孔(包括第一孔)各加基質(zhì)液100μl，室溫下避光作用5min~10min，加入終液50μl。

結果判定：以酶標儀在波長(cháng)492nm下測定吸光度0D值，待測標本OD值大于陰性對照3倍以上為陽(yáng)性，目測顏色為桶黃色或明顯高于陰性對照為陽(yáng)性。

5.5.1.3  ST檢測方法(抗原競爭法)   

包被：先在包被用ST抗原管中加0.5ml包被液，混勻后全部吸出于1. 6ml包被液中混勻，以每孔50μl加入于40孔聚苯乙烯軟反應板中。加液后輕輕敲板，使液體布滿(mǎn)孔底。第一孔留空作對照，置4℃冰箱濕盒中過(guò)夜。

洗板：用洗滌液I洗3次，操作同上。

封閉：每孔加100μl封閉液，37℃水浴比。

洗板：用洗滌液II洗3次，操作同上。

加樣本及ST單克隆抗體：每孔分別加各試驗菌株產(chǎn)毒培養液50μl、稀釋的ST單克隆抗體50μl (先在ST單克隆抗體管中加0.5mL稀釋液，混勻后全部吸出于1.6ml稀釋液中，混合)，37℃水浴1h。

洗板：用洗滌液II洗3次，操作同上。    •

加酶標記兔抗鼠1g復合物：先在酶標記免抗鼠1g復合物管中加0.5mL稀釋液，混勻后全部吸出于3.6mL稀釋液中混勻，每孔加100μl，37℃水浴1h。

洗板：用洗滌液II洗3次，操作同上。

酶底板反應：每孔(包括第一孔)各加基質(zhì)液100μl，室溫下避光5min~10min，再加入終止液50μl。

結果判定：以酶標儀在波長(cháng)492nm下測定吸光度OD值：

 

 

   目測無(wú)色或明顯淡于陰性對照為陽(yáng)性。

5.5.2 雙向瓊脂擴散試驗檢測LT

將被檢菌株按五點(diǎn)環(huán)形接種于E1ek氏培養基上。以同樣操作，共做兩份，于36℃培養48h。在每株菌苔上放多粘菌素B紙片，于36℃經(jīng)5h～6h，使腸毒素滲入瓊脂中，在距五點(diǎn)環(huán)形菌苔各5mm處的中央，挖一個(gè)直徑4mm的圓孔，并用一滴瓊脂墊底。在平板的中央孔內滴加LT抗毒素30μl，用已知產(chǎn)LT和不產(chǎn)毒菌作對照，經(jīng)15h～20h觀(guān)察結果。在菌斑和抗毒素孔之間出現白色沉淀帶者為陽(yáng)性，無(wú)沉淀帶者為陰性。

5.5.3 乳鼠灌胃試驗檢測ST

將被檢菌株接種于Honda氏產(chǎn)毒肉湯內，于36℃培養24h，以3000r／min離心30min，取上清液經(jīng)薄膜濾器過(guò)濾，加熱60℃30min，每mL濾液內加入2％伊文思藍溶液0.02mL。將此濾液用塑料小管注入1日齡一4日齡的乳鼠胃內0.1mL，同時(shí)接種3只～4只，禁食3h～4h后用三氯甲烷麻醉，取出全部腸管，稱(chēng)量腸管(包括積液)重量及剩余體重。腸管重量與剩余體重之比大于0.09為陽(yáng)性，0.07—0.09為可疑。

6 結果 

6.1 通過(guò)實(shí)驗，有否檢出致病性大腸艾希氏菌？

6.2 綜合以上生化試驗、血清學(xué)試驗、腸毒素試驗作出報告

7 思考題

1 致病性大腸艾希氏菌有哪幾種?主要引起哪幾種癥狀的疾病?

2 怎樣預防致病性大腸艾希氏菌引起的食物中毒?

3 致病性大腸艾希氏菌的檢驗程序。